Sawitza, Iris

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Iris Sawitza: Differentielle Signale während der myofibroblastischen Transdifferenzierung vonHepatischen Sternzellen. 2002Hepatische Sternzellen (HSC) sind sinusoidale, perizytenähnliche Zellen der Leber. Nach chronischerLeberschädigung differenzieren sie in myofibroblastische Zellen, die maßgeblich am Fortschreiten derLeberfibrose beteiligt sind. Im Zellkultursystem durchlaufen die Zellen einen der Leberfibrogeneseentsprechenden Transdifferenzierungsprozeß, der aber gegenüber dem in vivo Verlauf, in vitro auf 7Tage verkürzt ist. HSC in Primärzellkulturen bieten daher die Möglichkeit, den myofibroblastischenTransdifferenzierungsprozeß auf seine molekularen Zusammenhänge und Hintergründe zuuntersuchen. Daher wurden HSC aus der Ratte isoliert und das differentielle Expressionsmuster sowiewesentliche fibrogene und mitogene Signalwege in verschiedenen Stadien der myofibroblastischenDifferenzierung untersucht.Einer der wesentlichen fibrogenen Mediatoren ist Transforming Growth Factor ß (TGF ß), der aufepithelialen Zellen antiproliferativ wirkt, in mesenchymalen Zellen aber den verminderten Abbau unddie vermehrte Synthese extrazellulärer Matrixproteine induziert. Die durch TGF-ß initiierteintrazelluläre Signaltransduktion scheint in multiple Wege zu münden, die zum einen dasMAPK-Kaskade-Netzwerk umfassen. Nach Identifizierung der Smad-Proteine, konnte zum anderen inepithelialen Zellen ein direkter und zusammenhängender Signalweg für die TGF ß-Signaltransduktionbeschrieben werden.Mit Hilfe von Reporter-Assays an AP1 und Smad-responsiven Kontrollelementen wurde in derPromotionsarbeit gezeigt, dass es in Abhängigkeit von TGF ß, ebenfalls in Fibroblasten, nicht nur zueiner Aktivierung von AP-1 sondern auch des Smad-Signalweges kommt. Die Anreicherung der TGFß-Signaltransduktoren, Smad 2, 3 und 4 während der myofibroblastischen Differenzierung geht mitihrer Translokation in den Kern einher. In Electromobility Shift Assays konnte die Aktivierung vonAP1 und der Smad-Signalmediatoren durch die Bindung nukleärer Proteine an ein AP1-Response undein Smad Binding Element (SBE) dokumentiert werden. Die AP1-Bindung nimmt während dermyofibroblastischen Transdifferenzierung ab, während die Bindung von SBE moderat zunimmt. Beider Untersuchung des Smad-Transkript-Levels stellte sich heraus, dass sowohl Smad3 als auch Smad4nicht auf Transkriptionsebene reguliert werden.Insgesamt spricht die dargelegte autokrin stimulierte, posttranskriptionelle Aktivierung von Smad2/3und 4 in myofibroblastischen HSC für eine gegenüber der AP1-Aktivierung- zunehmenden Bedeutungdes Smad-Signalweges in der Vermittlung der fibrogenen TGF ß-Wirkung. Die Aktivierung von AP1,als einer der Zieltranskriptionsfaktoren der MAPK-Signalkaskaden, sowie die Analyse desdifferentiellen Expressionsmusters in ruhenden und myofibroblastischen HSC weisen dagegen auf einefrühe Stimulierung mitogener Signalwege hin. In Makro-Array-Analysen des Expressionsmusters vonHSC in verschiedenen Stadien der myofibroblastischen Differenzierung wurde neben der bekanntenExpression des mitogenen Faktors PDGF, auch die transiente Expression von neuronalen Faktoren wieNerve Growth Factor (NGF) gezeigt. Das differentielle Expressionsmuster von NGF in myofibroblastisch-aktivierten HSC wurde durchRNase-Protection-Assays und Realtime-PCR bestätigt. Neben NGF wird ebenfalls der NGF-RezeptorTrkA in frühen Stadien der myofibroblastischen Differenzierung gebildet. Immunologische Ansätzeund Kinase-Assays belegen die autokrine Stimulierung des Rezeptors TrkA durch NGF und dieanschließende Aktivierung des MAP-Kinase-Signalweges, die zu einer Phosphorylierung der Kinasen,ERK 1 und 2, führt. Als Antwort auf eine andauernde NGF-Stimulierung, wird der durch NGF/TrkAeingeleitete Signalweg über die MAP-Kinasen in späteren Stadien der myofibroblastischenDifferenzierung inhibiert. Die begrenzte Expression des apoptose-induzierenden NGF-Rezeptorsp75NTR auf späte Stadien der myofibroblastischen HSC-Entwicklung ergänzt das Bild einerautokrinen Signalalteration von aktivierenden, mitogenen zu fibrogenen und apototischen Signalen. Hepatic stellate cells (HSC) are regarded as one of the key cell types involved in the progression ofliver fibrosis. Transdifferentiation of HSC into a myofibroblastic cell type is the central mechanism of fibrogenesis.For this reason, HSC were isolated from rats and the differential expression of genes from differentstages of transdifferentiation was investigated. In addition important fibrogenic and mitogenicsignalcascades were examined.The fibrogenic mediator Transforming Growth Factor-ß (TGF-ß) is involved in the phenotypicalalterations of HSC by induction of extracellular matrix protein synthesis and cytoskeletal changes.TGF-ß initiates signalling through heteromeric complexes of type I and type II serine/threonine kinasereceptors. Activated TGF-ß receptor phosphorylates receptor regulated smad2/3 which then formcomplexes with the common- mediator smad4. This complexes translocate into the nucleus, wherethey regulate the transcription of target genes.As shown in the previous work smad proteins are synthesized in HSC. An increase in proteinexpression during HSC transdifferentiation could be observed by Western blotting andimmunocytochemistry. Enhanced activation and translocation in myofibroblastic HSC could bedemonstrated by autocrine TGF-ß stimulation. In electrophoretic mobility shift assays the binding ofan AP-1- and a smad-binding-element (SBE) could be shown. The AP-1-binding decreased duringtransdifferentiation whereas binding to SBE increased moderately. This shows the increasingimportance of the smad-mediated-pathway in later stages of HSC differentiation. Determining thesmad transcript level of HSC no transcriptional regulation of smad3 or smad4 could be shown.In conclusion the enhancement of smad2/3 and 4 protein synthesis and translocation duringmyofibroblastic transdifferentiation leads to the suggestion 1. that the smad-mediated signaltransduction of TGF-ß is involved in the progression of liver fibrogenesis and 2. that inmyofibroblastic HSC the TGF-ß signalling smad-pathway is activated by autocrine stimulatedposttranslational modification of Smad2/3 and 4.By macroarray analysis the altered expression of the mitogenic nerve growth factor (NGF) duringmyofibroblastic differentiation was identified. Since NGF mediates cellular processes likedifferentiation, proliferation and apoptosis by different receptors, the TrkA and the p75NTR, thereceptor expression and signalling in HSC during myofibroblastic development was studied.For this reason isolated rat HSC and HSC induced to myofibroblastic differentiation by primaryculture (1 to 10 days), were used for immunocytochemistry, RNA extraction and preparation of proteinextracts. Transcript levels of NGF and its receptors were analysed by RNase- Protection-Assays andReal-Time-PCR. Protein and phosphorylation levels of signal transducers (TrkA, Erk 1 and 2 , JNK)were investigated by immunoblotting or kinase assays. Neutralizing NGF antibodies were used forinhibition of autocrine NGF stimulation.The p75NTR receptor, affecting apoptosis and cell proliferation, is expressed in late stages ofmyofibroblastic differentiation. In contrast, both, NGF and the TrkA receptor, are transientlysynthesized in HSC upon early myofibroblastic activation, shown on protein and transcript level.Autocrine stimulation of the TrkA receptor results in activation of the MAPK pathway and inphosphorylation of Erk 1 an 2. In reponse to long term autocrine NGF stimulation, however,NGF/TrkA initiated MAPK signalling is inhibited. It was demonstrated that the loss of NGF mediatedMAPK activation is attributed to the decrease of TrkA receptors upon autocrine NGF stimulation.In conclusion, the autocrine NGF stimulation takes part in early cellular HSC activation by TrkAstimulation of MAPK mediated signal transduction. TrkA induced signalling, however, is subject of anegative feed back regulation, which is suggested to an altered signal transduction in myofibroblasticHSC expressing the p75NTR receptor. 

Differentielle Signale während der myofibroblastischen Transdifferenzierung von Hepatischen Sternzellen

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