La semilla es un órgano clave en el ciclo de vida de las plantas y su capacidad para permanecer en estado de quiescencia y germinar sólo cuando las condiciones ambientales son favorables ha representado una ventaja evolutiva y permitido el desarrollo de la agricultura. La germinación comienza con una absorción de agua que permite la expansión celular y reiniciar el metabolismo. En sentido estricto, la germinación termina cuando la elongación del eje embrionario permite a la radícula penetrar la cubierta de la semilla. Durante la fase postgerminativa, las sustancias de reserva almacenadas en la semilla son utilizadas para el crecimiento de la plántula hasta que ésta es capaz de fotosintetizar. Los ácidos giberélico (GA) y abscísico (ABA) son las dos hormonas más importantes en el control de la germinación. Diferentes factores ambientales y genéticos son capaces de afectar al balance ABA/GA y el descenso de los niveles de ABA e incremento de los de GA durante la germinación reflejan su papel negativo y positivo, respectivamente, en este proceso. En cereales, los genes de hidrolasas que movilizan las sustancias de reserva responden al GA mediante un motivo en cis tripartito conservado llamado GARC que es reconocido por factores de transcripción (TFs) de las familias MYB (R2R3 y R1) y DOF. Sin embargo, el GARC no parece estar presente en los promotores inducibles por GA en dicotiledóneas (Ogawa et al., 2003) y las diferencias en la respuesta a ABA entre la capa de aleurona de cereales y el endospermo de las dicotiledóneas (Penfield et al., 2006), apunta a la existencia de mecanismos de regulación diferentes. Estamos abordando el estudio de estos mecanismos mediante dos aproximaciones diferentes para identificar y caracterizar elementos en cis y factores de transcripción implicados en la germinación de la dicotiledónea Arabidopsis thaliana

Barrero Sicilia, Cristina

Carbonero Zalduegui, Pilar

Oñate Sanchez, Luis

Rueda Romero, Paloma

Vicente Carbajosa, Jesus

Servicio de Coordinación de Bibliotecas de la Universidad Politécnica de Madrid

FITOHORMONAS: METABOLISMO Y MODO DE ACCIÓN. Sesión III. 133 
El gen DOFG4 de Arabidopsis participa en la regulación de la 
germinación de la semilla mediada por ABA 
 
L. OÑATE-SÁNCHEZ, C. BARRERO, P. RUEDA,  
J. VICENTE-CARBAJOSA, P. CARBONERO 
 
Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular. Dpto. de Biotecnología-
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas-Universidad Politécnica de 
Madrid. ETSI Agrónomos. Ciudad Universitaria s/n. 28040 Madrid, España. 
 
 
Introducción 
La semilla es un órgano clave en el ciclo de vida de las plantas y  su 
capacidad para permanecer en estado de quiescencia y germinar sólo cuando 
las condiciones ambientales son favorables ha representado una ventaja 
evolutiva y permitido el desarrollo de la agricultura. La germinación 
comienza con una absorción de agua que permite la expansión celular y 
reiniciar el metabolismo. En sentido estricto, la germinación termina cuando 
la elongación del eje embrionario permite a la radícula penetrar la cubierta de 
la semilla. Durante la fase postgerminativa, las sustancias de reserva 
almacenadas en la semilla son utilizadas para el crecimiento de la plántula 
hasta que ésta es capaz de fotosintetizar. 
Los ácidos giberélico (GA) y abscísico (ABA) son las dos hormonas 
más importantes en el control de la germinación. Diferentes factores 
ambientales y genéticos son capaces de afectar al balance ABA/GA y el 
descenso de los niveles de ABA e incremento de los de GA durante la 
germinación reflejan su papel negativo y positivo, respectivamente, en este 
proceso.  En cereales, los genes de hidrolasas que movilizan las sustancias de 
reserva responden al GA mediante un motivo en cis tripartito conservado 
llamado GARC que es reconocido por factores de transcripción (TFs) de las 
familias MYB (R2R3 y R1) y DOF. Sin embargo, el GARC no parece estar 
presente en los promotores inducibles por GA en dicotiledóneas (Ogawa et 
al., 2003) y las diferencias en la respuesta a ABA entre la capa de aleurona de 
cereales y el endospermo de las dicotiledóneas (Penfield et al., 2006), apunta 
a la existencia de mecanismos de regulación diferentes. Estamos abordando el 
estudio de estos mecanismos mediante dos aproximaciones diferentes para 
identificar y caracterizar elementos en cis y factores de transcripción 
implicados en la germinación de la dicotiledónea Arabidopsis thaliana. 
 
 
 
 
 134                                              ISABEL DIAZ RODRIGUEZ, MANUEL MARTINEZ MUÑOZ 
 
Resultados y Discusión 
Identificación y caracterización de TFs tipo DOF implicados en la 
germinación 
La activación de genes de hidrolasas durante la germinación de semillas de 
monocotiledóneas está controlada principalmente por el factor de 
transcripción GAMYB, inducible por GA, que reconoce el elemento GARE 
del complejo GARC presente en los promotores de los genes regulados (Sun 
y Gubler, 2004). Junto con GAMYB, los TFs tipo DOF, SAD, BPBF, DOF17 
y DOF19, son reguladores negativos, excepto SAD que es activador, de esta 
respuesta mediante su unión a la caja de pirimidinas presente en el complejo 
GARC (Isabel-LaMoneda et al., 2003; Mena et al., 2002; Moreno-Risueño et 
al., 2007). En Arabidopsis, los TFs tipo DOF, DAG1 y DAG2 son 
reguladores negativo y positivo, respectivamente, de la germinación 
(Gualberti et al., 2002). Para tratar de identificar otros TFs tipo DOF 
involucrados en esta regulación realizamos PCRs cuantitativas en tiempo real 
(RT-qPCR) sobre muestras de semillas de Arabidopsis en germinación con 
oligonucleótidos específicos de genes de la familia DOF (Figura 1). Los genes 
DAG1 (dato no mostrado) y DAG2 presentaban cinéticas semejantes de 
expresión con una inducción gradual, alcanzando sus niveles máximos en la 
etapa postgerminativa (≥48horas). El gen BME3, TF dedo de zinc tipo GATA, 
es un regulador positivo de la germinación cuyos mRNAs comienzan a 
acumularse un poco antes de la germinación (Liu et al., 2005). De todos los 
genes DOF analizados el gen DOFG4 presentaba una inducción temprana y 
alcanzaba niveles máximos de expresión a las 6 horas de la germinación, lo 
que sugería que podría desempeñar un papel en fases tempranas de la 
germinación y diferente a la de otros genes caracterizados. 
Mediante experimentos de hibridación in situ se demostró que el 
mRNA de DOFG4 está presente en el embrión en etapas tempranas de 
germinación (Figura 2). En tinciones de plantas transgénicas con el promotor 
de DOFG4 fusionado a GUS se observó que la actividad del promotor se 
localiza principalmente en el sistema vascular a partir de la etapa 
postgerminativa (dato no mostrado). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Cuantificación de la expresión de los genes DAG2, BME3 y DOFG4 durante la 
germinación de semillas de Arabidopsis mediante RT-qPCR. En abscisas se representan 
horas de germinación a 22°C (16h luz-8h oscuridad) tras la estratificación (48 horas a 4°C 
en oscuridad; E); 0: semilla seca; *: horas en alcanzar un 50% de germinación. 
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
BME3
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
DAG2
0.03
0.09
0.15
*
* DOFG4
0.01
0.02
0.03
0 E 3 6 9 12 24 30 36 48
*
0 E 3 6 9 12 24 30 36 480 E 3 6 9 12 24 30 36 48E
xp
re
si
ón
 re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
FITOHORMONAS: METABOLISMO Y MODO DE ACCIÓN. Sesión III. 135 
 
 
 
 
 
 
 
 
Se confirmó la existencia de un mutante de inserción TDNA (SALK) 
en el gen DOFG4 y se verificó la disminución de los niveles de su mRNA en 
comparación con plantas silvestres (Figura 3A y 3B). Se analizaron estas 
plantas (kodofg4) mediante ensayos de germinación en los que se evaluaron 
diferentes estímulos y condiciones: estratificación, luz, azúcares, 
paclobutrazol (PAC), ABA y GA. Las plantas kodofg4 resultaron ser más 
sensibles a ABA durante la germinación (Figura 3C). Plantas con expresión 
constitutiva (promotor 35S) de DOFG4 (DOFG4oex) presentan un tamaño 
considerablemente inferior a las silvestres (Figura 4A y 4B). Ensayos 
preliminares de germinación con dos líneas no segregantes de plantas 
DOFG4oex parecen indicar una menor sensibilidad a ABA en comparación 
con el control silvestre (Figura 4C). En conjunto, estos resultados indican que 
DOFG4 podría ser un regulador de las respuestas a ABA durante la 
germinación. Para confirmar o rechazar esta hipótesis estamos realizando 
análisis globales de expresión génica con micromatrices durante la 
germinación de plantas kodofg4 y DOFG4oex. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Caracterización de un mutante de inserción en el gen DOFG4. A, esquema 
mostrando la estructura génica de DOFG4 y la posición de la inserción. B, cuantificación 
del RNA de DOFG4 mediante RT-qPCR en plantas  de 15 días silvestres (S) y el mutante 
de inserción kodofg4. Los cebadores empleados están representados como puntas de flecha 
antisentido sentido
DOFG4
Figura 2. Hibridación in situ en semillas en 
germinación con sondas sentido y antisentido del 
gen DOFG4. 
SALK 500bp
Intrón
UTR
Exón
Dominio DOF
Cebador sentido
Cebador antisentido
A
20
40
60
80
100
S
kodofg4
%
 g
er
m
in
at
io
n
1 2 3 4 5
días
%
 g
er
m
in
at
io
n
%
 g
er
m
in
at
io
n
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5
días
ABA 1μM
C
0,01
0,02
0,03
0,04
S kodofg4
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
to
U
B
C
R
el
at
iv
e
ex
pr
es
si
on
to
U
B
CB
 136                                              ISABEL DIAZ RODRIGUEZ, MANUEL MARTINEZ MUÑOZ 
 
en el apartado A. C, Ensayos de germinación en presencia o ausencia de ABA utilizando 
semillas de plantas silvestres (S) y plantas kodofg4. Los porcentajes de germinación 
representan la media y errores estándar de 3 réplicas biológicas de 100 semillas cada una. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Caracterización de plantas con sobreexpresión del gen DOFG4. A, 
cuantificación de la expresión del gen DOFG4 en plantas DOFG4oex mediante RT-qPCR. 
B, fenotipo de plantas DOFG4oex. C, ensayos de germinación en presencia o ausencia de 
ABA con  semillas de plantas silvestres (S) y plantas DOFG4oex. 
 
Identificación de elementos en cis y reguladores involucrados en la 
germinación de semillas de la dicotiledónea Arabidopsis thaliana. 
Hemos realizado un análisis global de la expresión génica durante la 
germinación de las semillas de Arabidopsis mediante hibridación con 
micromatrices de Affymetrix y hemos incorporado a este análisis perfiles 
existentes en bases de datos públicas. Como resultado identificamos genes 
con alta expresión, y en algunos casos, específica durante la germinación de la 
semilla. Hemos confirmado y caracterizado las cinéticas de expresión de los 
genes identificados mediante RT-qPCR en muestras de semillas en 
germinación de Arabidopsis. Algunos de los genes analizados muestran 
elevada expresión y cinéticas diferentes aunque solapantes, y representan 
clases génicas involucradas en aspectos importantes de la germinación como 
remodelación celular, síntesis de GA, catabolismo de lípidos y proteínas, etc. 
Seleccionamos el gen de una lipasa (LIP) para caracterizar su promotor e 
identificar elementos funcionales en cis y sus posibles TFs en trans (Figura 
5). Mediante análisis in silico se identificaron motivos consenso para factores 
de transcripción previamente descritos así como otros no descritos 
previamente. Entre estos motivos destacan 2 dianas para TFs tipo DOF y una 
para TFs tipo bZIP muy próximas. En función estos análisis se prepararon 
delecciones del promotor y se fusionaron al gen delator de la luciferasa para 
analizar la contribución de estos elementos a la expresión del gen. Se 
generaron plantas transgénicas con las construcciones mencionadas y se 
cuantificó la actividad luciferasa in vivo durante la germinación. Los 
resultados muestran que la delección de regiones que contenían los sitios 
DOF y bZIP produce cambios notables en la actividad del delator in vivo 
durante la germinación. 
 
Silvestre DOFG4oex
A B C
1 2 3 4
S
DOFG4oex 2
DOFG4 oex 4
20
40
60
%
 g
er
m
in
at
io
n
%
 g
er
m
in
at
io
n
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
DOFG4
0,2
0,4
0,6
0,8
S 1 2 3 4 5
DOFG4oex
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
FITOHORMONAS: METABOLISMO Y MODO DE ACCIÓN. Sesión III. 137 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Análisis de la expresión del promotor del gen LIP. A, esquema de las 
construcciones generadas para la transformación estable de plantas de Arabidopsis. B, 
Cuantificación de la expresión de la luciferasa mediante una cámara CCD digital 
refrigerada durante la germinación de las semillas de las plantas transgénicas generadas 
(valores medios y errores estándar de al menos 10 líneas para cada construcción). 
 
Las cinéticas de expression de los mRNAs de DOFG4 y LIP eran 
compatibles con la hipótesis de que el primero fuera un regulador del 
segundo. Para comprobarlo realizamos RT-qPCR sobre muestras de mRNAs 
de plantas DOFG4oex. Los resultados muestran que 3 de las 5 líneas 
analizadas presentan una reducción en la expresión la lipasa en comparación 
con el control (S, silvestre). En una de las 5 líneas no se pudo detectar el 
tránscrito, quizá debido a su baja abundancia (Figura 7). Estos resultados 
indican que DOFG4 pudiera actuar como un regulador negativo del gen LIP 
durante la fase vegetativa del crecimiento. El papel regulador durante la 
germinación de la semilla está siendo analizado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Cuantificación de la expresión del 
gen LIP durante la germinación de semillas de 
Arabidopsis mediante RT-qPCR. Los números 
en itálica dentro del histograma representan los 
niveles de inducción relativos a la muestra E. 
El resto de la leyenda es como en la figura 1. 
LUCIFERASE
-846
2
1
3
4
DOF
bZIP
A B
Figura 7. Cuantificación de la expresión 
del gen LIP en plantas DOFG4oex 
mediante RT-qPCR. S: plantas silvestres; 
1 a 5: diferentes líneas de plantas 
DOFG4oex. n/d: no detectado. 0,4
0,8
1,2
1,6
S 1 2 3 4 5
n/d
DOFG4oex
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
LIP
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
2
4
6
8
10
Control 1 2 3 4L
uc
ife
ra
se
ac
tiv
ity
(x
10
4 )
Lu
ci
fe
ra
se
ac
tiv
ity
(x
10
4 )
LIP
0 E 3 6 9 12 24 30 36 48
1
2
3
4
5 3.991
5
*
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
Ex
pr
es
ió
n 
re
la
tiv
a 
a 
U
B
C
 138                                              ISABEL DIAZ RODRIGUEZ, MANUEL MARTINEZ MUÑOZ 
 
Agradecimientos 
Inmaculada Gude proporcionó excelente asistencia técnica. Este trabajo fue 
financiado por el Ministerio de Educación y Ciencia (MEC BMC2006-
07258), Universidad Politécnica de Madrid (UPM-M 0700204101), 
Fundación Genoma España trilateral TRI21/REGULATORS y Marie Curie 
International Reintegration Grant (36524) a LO.  L.O., C.B. y P.R. están 
financiados respectivamente por un contrato Ramón y Cajal del MEC, un 
contrato Juan de la Cierva-UPM y una beca FPI del MEC. 
 
Bibliografía 
Gualberto G, Papi M, Bellucci L, Ricci I, Bouchez D, Camilleri C, 
Costantino P, Victorioso P (2002) Mutations in the dof zinc finger 
genes DAG2 and DAG1 influence with opposite effects the germination 
of Arabidopsis seeds. Plant Cell, 14, 1253–1263. 
Isabel-LaMoneda I, Díaz I, Martínez M, Mena M, Carbonero P (2003) 
SAD: a new DOF protein from barley that activates transcription of a 
cathepsin B-like thiol protease gene in the aleurone of germinating seeds. 
Plant J 33, 329-340.  
Liu P, Koizuka N, Martin RC, Nonogaki H (2005) The BME3 (Blue 
Micropylar End 3) GATA zinc finger transcription factor is a positive 
regulator of Arabidopsis seed germination. Plant J 44, 960-971.  
Mena M, Cejudo FJ, Isabel-Lamoneda I, Carbonero P (2002) A role for 
the dof transcription factor BPBF in the regulation of gibberellin-
responsive genes in barley aleurone. Plant Physiol 130, 111–119. 
Moreno-Risueño MA, Díaz I, Carrillo L, Fuentes R, Carbonero P (2007) 
The HvDOF19 transcription factor mediates the abscisic acid-dependent 
repression of hydrolase genes in germinating aleurone. Plant J 51, 352-
365. 
Ogawa M, Hanada A, Yamauchi Y, Kuwahara A, Kamiya Y, Yamaguchi 
S (2003) Gibberellin biosynthesis and response during arabidopsis seed 
germination. Plant Cell 15, 1591–1604. 
Penfield S, Li Y, Gilday AD, Graham S, Graham IA (2006) Arabidopsis 
ABA insensitive 4 regulates lipid mobilization in the embryo and reveals 
repression of seed germination by the endosperm. Plant Cell 18, 1887–
1899. 
Sun T, Gubler F (2004) Molecular mechanism of gibberellin signaling in 
plants Annu Rev Plant Biol 55, 197–223. 


El gen DOFG4 de Arabidopsis participa en la regulación de la germinación de la semilla mediada por ABA

Archivo Digital UPM

http://oa.upm.es/3945/1/INVE_MEM_2008_57933.pdf

El gen DOFG4 de Arabidopsis participa en la regulación de la germinación de la semilla mediada por ABA

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Servicio de Coordinación de Bibliotecas de la Universidad Politécnica de Madrid

Archivo Digital UPM