August Pi Suñer

Pi Suñer, August

Hemeroteca Cientifica Catalana

Un método sencillo para la determinación cuantitativa del glucógeno en los tejidos POR A. PI SUÑER N uestros experimentos sobre sensibilidad trófica hacían necesari o un método que permitiera medir con seguridad y comodidad la can-tidad de glucógeno contenido en el hígado. El procedimiento de Pflüger (I), el mas generalmente utilizado, da resultados excelentes, pero es mas largo, complicado y costoso que el nuestro. Consiste, como es sabido, en digerir el tejido en lejía de potasa al 6o por 100 y precipitar el glucógeno por medio del alcohol fuerte. Posteriormente Bierry y Gruzewska (2) han recomendado una técnica mas complicada: tratamiento por la potasa al 35 por IOO a 120° durante 30 minutos, neutralización por el clorhídrico, precipi-tación de los proteicos por el nitrato mercúrico, hidrolisis por el ClH a I20° durante media hora y determinación de la cantidad de glucosa resultante por el método de Bertrand. Los otros métodos de separación de los proteicos hepaticos, incluyendo en ellos el proce-dimiento de Brücke y Kulz no son tampoco lo suficientemente segu-ros y sencillos (3). N osotros hemos llegado a un procedimiento de una extrema sen-cillez y que nos ha dado los mejores resultados; la cocción del hígado muy dividido en pequeños trocitos, en solución acética al tercio por (1) E. PFLÜGER: Das Glycogen, 2.a ed., pag., 104. 1905, y Archiv. f. d. ges. Phys. CXIV-246. 1905. (2) BIERRY Y GRUZEWSKA: C. R. de l"Acad. de Seien. CLV-1559. 19r2. (3) E. PFLÜGER: Archi·v. die ges. Phys. CIII-169. 1904· 7 ciento y tratamiento consecutiva por alcohol de 96, según Pflüger. El tratmiento por el reactivo de Brücke (solución de yoduro mercú-rico y yoduro po tas ico) recomendado por Abderhalden como coagu-lante de los proteicos, es, a nuestro parecer, absolutamente superfluo. Hemos fijado la técnica como sigue : so c. c. de acido acético en agua destilada a 0'33 por IOO, casi a la temperatura de ebullición, se ponen tarados en un erlenmeyer, sobre una balanza. Se saca del animal un trozo de hígado de S a IO gramos - por la costumbre se llega pronto a conocer sus dimensiones - y muy dividido, se incor-pora a la solución anterior, que no debe haberse dejado enfriar, sino que tiene que mantenerse a temperatura superior a la de la in-activación de las diastasas y coagulación de los proteicos. Se pesa el hígado incorporada. Anotado el peso- la pesada de be hacerse con toda exactitud, pues es el dato que luego nos dara el tanto por ciento de glucógeno - se inicia la ebullición de la solución acética y enseguida se coloca el erlenmeyer en un baño maría anteriormente dispuesto y ya en ebullición, en el cua! se deja durante un cuarto de hora. Pasado este tiempo, se decanta y se completa la trituración del hígado en un mortero con poco líquido y polvo de vidrio. El hígado ha de quedar convertido en una pa pilla fina; se agrega otra vez agua caliente y pasa todo de nuevo al baño maría durante una hora, asegurandose al final de que ha desaparecido todo olor a acido acé-tico, que, por la ebullición, se volatiliza muy pronto. Se deja macerar durante veinticuatro horas a la temperatura del laboratorio. Después se separa el líquido por filtración (que se puede ayudar con la trompa), y se prueba si al lavar el líquido con nueva agua, se produce en ella precipitada tratandola por el alcohol y si da reacción positiva con el yodo. En general el agua del primer lavado ya no demuestra la presencia del glucógeno, pero para asegu-rarse de que no se escape ni la mas pequeña cantidad, se lava sobre el filtro con un volumen mitad del del líquido recogido. Y así se continúa basta agotar el glucógeno del tejido. La solución acuosa obtenida por la filtración se trata por doble volumen de alcohol de 96 y se deja reposar 24 horas o se precipita por centrifugación. Se lava el precipitada obtenido con alcohol y éter y se mide su glucógeno, ya sea por pesada después de su desecación -lo mejor es practicar diversas pesadas a intervalos regulares, guar-dando el glucógeno en la estufa a SSo con sulfúrico basta conseguir la estabilización del peso, por desecación completa - ya por polari-metría o por hidrolisis mediante el tratamiento con ClH, acidifidm-dolo en forma que la solución de glucógeno contenga un 2'2 por 100. 8 Calentando la solución acida al baño maría durante tres horas y dejandola enfriar después, se añade con una bureta la cantidad de lejía de potasa necesaria par alcalinizarla ligeramente. Se investiga ahora la proporción de glucosa por alguno de los métodos corrientes : Pflüger, Benedict, Bertrand, Carrasco. La maceración en la solución acética arrastra el glucógeno, y sólo queda en ella como cuerpo org{mico el glucógeno, después de haber sido los proteicos coagulados por la ebullición en medio acido. Por otra parte, el acido acético no hidroliza el glucógeno porque es un acido poco disociable y que desaparece muy pronto - siendo vola-tiJ - a consecuencia de la ebullición prolongada. Mediciones compa-radas de la proporción de glucógeno en una solución antes y des-pués de hervirlo en la solución acética por nosotros empleada y en las condiciones de nuestro método, no demuestran que haya hidrolsis. En el líquido donde se disuelve el glucógeno obtenido después de los lavados en alcohol y éter, no es posible revelar la presencia de al-búminas; quedaron en el tejido coagulada y también en el alcohol de precipitación algunos amino-acidos, demostrables por algunas reac-ciones coloreadas, como la de Millon. Del tejido del hígado, en cam-bio, ya hemos dicho que nos hemos llevado todo el glucógeno por repetides lavados hasta la extracción completa. Determinaciones com-paradas del mismo hígado sirviéndonos de nuestro método y del de Pflüger nos han dado iguales resultades. En nuestros experimentes sobre Ja dt>scarga de glucógeno por el hígado, especialmente por Ja ligadura de la aorta, hemos obtenido resultades satisfactorios. Agradezco cordialmente a mi interno señor Gómez Bosch su inte-ligente ayuda en estos trabajos. No ta adicional.-Hemos ensayado una mayor simplificación del método con resultades que parecen favorables. Es maceración suficiente del hígado en agua acética caliente la de dos horas. Ademas separamos rapidamente el tejido hepatico del lí-quido de maceración por centrifugación. Procedemos al lavado sobre el filtro al vacío y no precipitamos el glucógeno. Directamente se in-corpora la necesaria cantidad de CIR- que resulte al 2'2 por 100 en la mezcla total - y procedemos a Ja hidrolisis. Esta puede obtenerse al baño maría duran te tres ho ras o en el autoclave a I 20° duran te 30 minutos. Se determina la cantidad de glucosa resultante por el Be-nedict: roo gramos de glucosa corresponclen a 0'927 de glucógeno Publicado en el sexto volumen de TR!iBALLS DE LA SOCIETAT DE BIOLOGIA, I9I8, pag. 43· 9 

Un método sencillo para la determinación cuantitativa del glucógeno en los tejidos

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