Advanced optical microscopy for life sciences: from optical sections to optical nanodissection

Abstract

La microscòpia òptica ha patit una gran revolució en les darreres tres dècades amb l’arribada dels làsers i les proteïnes fluorescents. Sent capaços de marcar individualment molècules i proteïnes en cèŀlules i organismes vius, ara els científics poden observar múltiples components ceŀlulars i proteïnes simultàniament, al llarg dels diferents compartiments i teixits, i també veure la interacció d’aquests entre si. Com que la microscòpia de fluorescència moderna està esdevenint una veritable microscòpia molecular amb tècniques específiques per a l’estudi de dinàmica de proteïnes com el FRAP o el FRET, la capacitat dels microscopis òptics de generar imatges altament resolutives, tant en la dimensió espacial com en la temporal, ha millorat dràsticament. En aquest capítol revisem els principis bàsics de la fluorescència, la preparació de mostres biològiques i els conceptes òptics darrere els quals es troba la capacitat de la microscòpia confocal de generar imatges tridimensionals a partir de seccions òptiques. També abordem tècniques basades en la manipulació amb làsers com la nanocirurgia per làser i en discutim aplicacions modernes dins de la biologia ceŀlular i del desenvolupament, en especial l’ablació ceŀlular i la cirurgia intraceŀlular, les quals han esdevingut avui dia eines importants per interactuar amb teixits pluriceŀlulars, ja que ens permeten avaluar forces i estats biomecànics de les cèŀlules durant processos importants del desenvolupament dels organismes. Finalment, expliquem els principis d’un dels últims avenços en l’adquisició d’imatges de fluorescència, la microscòpia en full de llum, que permet als científics esquivar les principals limitacions de les microscòpies convencional i confocal, ja que ofereix les capacitats d’adquirir imatges en profunditat en llargs períodes de temps.Paraules clau: microscòpia òptica, microscopi confocal, làser, fluorescència, full de llum.Optical microscopy has undergone several revolutions in the past three decades with the advent of lasers and fluorescent proteins. By being able to label single molecules and proteins in living cells and organisms, scientists can now observe multiple cellular components and proteins simultaneously, moving across compartments and tissues and interacting with each other. As modern fluorescence microscopy is turning into truly molecular microscopy with specific techniques for the study of protein dynamics like FRAP or FRET, the capability of optical microscopes to generate highly resolved images, both in spatial and temporal dimensions, is also dramatically improving. In this chapter, we review the basic principles of fluorescence, the preparation of biological samples and the optical concepts behind the capability of confocal microscopy to generate threedimensional images on the basis of optical sections. We also approach laser based manipulation techniques such as laser nanosurgery and discuss modern applications in cell and development biology, in particular how cell ablation and intracellular surgery have now become important tools for interacting with multicellular tissues since they allow the probing of forces and biomechanical states of cells during important development processes of organisms. Lastly, we set forth the principles of one of the latest advances in fluorescence imaging, light sheet microscopy, which allows experimentalists to circumvent several major limitations of conventional and confocal microscopy by offering the capability of imaging deeply and for very long periods of time.Keywords: optical microscopy, confocal microscope, laser, fluorescence,light sheet