Fermín Rivera

Roser Casamitjana Abella

Rivera, Fermín

Casamitjana Abella, Roser

Hemeroteca Cientifica Catalana

ASPECTES TEORICS DE L'ANALISI DE SATURACIO.APLICACIO D'AQUESTA A LA DETERMINACIODE PROGESTERONA *Comunicacio presentada el dia 18 de gener de 1973pels doctorsF. RIVERAiR. CASAMITJANADel Laboratori Central de Bioquimica de ]a Facultat de Medicinade la Uni%ersitat de Barcelona(Cap (let Servei: Dr. A. Corominas i Vilardell)* Trcball realitzat amb 1'ajut 2.2 . 6. del (III Plan de Desarrollo».Tant el radioimmunoassaig com el PCB son formes una mica diferents(Fun nou metode analitic anomenat uanalisi de saturacio » o de udespla-cament ». Ambdos es basen en una reaccio competitiva que podriem esque-matitzar aixi :a) En el cas del PCB:S + Q -^ SQSQ+SZ-- SQ + SQ + S + SEn que S es una hormona que to una gran efinitat amb la proteinab) En el cas del radioimmunoassaig:Ag (F) + Ab(antigen marcat ) (anticbsespecific)Ag - Ab (B)(complex antigen-anticos marcat)Ag(antigen no marcat)itAg-Ab(complex antigen-anticos no nrarcat)Q.La tecnica, en general, to corn a fonament 1'habilitat de l'hormona nomarcada per a desplacar dhormona marcada lluny dels seus punts d'unioamb l'anticbs o arnb la proteina en general. Per tant, en el cas del RIE,la relacio B/F va disminuint a mesura que augmenta la quantitat d'hor-mona no marcada.Tenint en compte les caracteristiques de l'analisi de saturacio, hom veuclarament que la tecnica pot esser aplicada a la determinacio de moltessubstancies, i molt diverses: vitamines, glucosids, digitalics, nucleotids, i, ames, tota mena d'hormones: insulina, TSH, HGH, gastrina, paratohormo-na, progesterona, etc.774 F. RIVERA I R. CASAMITJANAEls avantatges que presenten aquestes tecniques en relacio amb altresusades anteriorment, poden esser resumits aixi :a) Necessiten una quantitat molt petita de plasma.b) Son metodes rapids que requereixen poques bores de treball.c) La realitzacio es senzilla i, per aixo, no es necessari personal al-tament especialitzat.d) Tenen una elevada sensibilitat, i fins arriben a detectar quanti-tat petitissimes de subs tancia-problema.A partir d'adui, farem les consideracions generals sobre les (tecniquesde saturacio)), basant-nos en el primer esquema, es a dir, el que fa referen-cia al PCB. Posarem una atencio especial en les conditions en que ha d'es-ser duta a terme, a fi d'evitar al maxim els errors.En primer lloc, el compost marcat ha de trobar-se altament purificat iha de tenir caracteristiques identiques -o molt semblants- a les del com-post problema, a fi que la reaccio amb Q es faci en els mateixos puntsd'unio. Qualsevol diferencia quimica entre ambdos, que doni hoc a unadiferencia d'energies de reaccio enfront de Q, afectara la precisio i la sen-sibilitat de l'analisi.En segon lloc, Q ha de reaccionar especificament amb S de forma quea aquesta reaccio no 1'afectin altres components.Un cas facil d'interferencia es donaria en el cas que hi hagucs duesmolecules pertanyents a un mateix grup antigenic S i, per tant, amb lamateixa afinitat amb Q, encara que totalment diferents biologicament; enaquest cas, Q seria incapac de distingir-les i restarien, aixi, alterats cls re-sultats de la reaccio.En darrer lloc, Q hi ha d'esser present en una proporcio que li permetide quedar saturat per S i, aixi, la quantitat d'aquest resta limitada per ladel primer. A mes, l'energia de reaccio entre ambdos ha d'esser prou ele-vada per a assegurar que, a aquestes concentrations, no es possible 1'exis-tencia de grans quantitats de S lliure ni de flocs de reaccio de Q noocupats.Fetes aquestes consideracions previes, ja podem fer un esquema gene-ral de la marxa del proces analitic i ja n'estudiarem mes endavant elspassos detalladament, quan l'aplicarem a la determinacio de la proges-terona.78ASPECTES TEORICS DE L'ANALISI DE SATURACIOPASI) Preparacio de la mostra.a) Desproteinitzaci6.b) Purificaci6.2) Quantificacio.a) Equilibri de 1'elementmarcat amb la proteY-na analitzada.b) Separaci6 de 1'ele-ment problema unita la proteina de 1'ele-ment lliure.FINALITATSeparaci6 de la proteina.Separaci6 de comp. analegs.Permet, a I'element proble-ma i a 1'element marcat,d'unir-se a la proteina pro-porcionalment a Ilurs con-centracions.Determina la distribuci6 dela radioactivitat.MITJX5Escalfament.Dissolvents organics.Repartimcnt entre dissol-vents.Cromatografia en CF.Idem en paper.fdem en columna.Mescla a temperatura am-bient i refredament a io °Co menys.Dialisi.Electroforesi.Precip. de proteines.Adsorci6 de la fracci6 nomarcada a particules inso-lubles.Els dos primers passos no solen presentar dificultat de realitzacio sitenim la cura de fer una dilucio adequada de la mostra; veurem la impor-tancia d'aquesta precaucio si ens fixem en les corbes de la figura i.La precisio final es mes gran corn mes elevada es la dilucio del plasma.Per a aconseguir 1'equilibri optim entre 1'element marcat i la proteina,es aconsellable de treballar a baixes temperatures, de io °C o menys.La separacio de les fractions ((lliure)) i ((lligada)) pot esser duta a termeper diversos camins. En el cas de les hormones esteroides (p. e. la proges-terona), ha estat emprat el Florisil, substancia insoluble que absorbeixamb facilitat la fraccio d'hormona Iliure. En aquest procediment el re-compte es fa a partir de la fraccio lligada.En qualsevol sistema emprat, cal tenir en compte que el temps de re-compte es un factor critic, puix que la reaccio entre l'absorbent i l'hormo-na lliure es essencialment irreversible, mentre que la que es produeix entrela proteina i dhormona lliure es facilment reversible. Si retardem el tempsde recompte, la reaccio hormona-proteina es desplacada cap a l'esquerra i,per aixb, es produeix un descens progressiu en el percentatge d'elementmarcat unit a la proteina.El mesuratge de l'horinona-problema es, doncs, de tipus indirecte i homsol fer-lo comparant els resultats amb unes corbes standard, com veuremmes endavant.79cccCl)ECDC5CDSubs. problema afegida.Reduccio de la quantitatamb volum constant.FIG. IMETODE RAPID DE LA PROGESTERONA (Johansson 1969)Eter depetroli 25 ml.Agitar 1 min.CentrifugarPlasma 0,25mI. 0CBG BH31 ml.Evaporar asequetatamb afireDioxaFlorisil PPO. POPOP80 mg. Naftale5 min.a 40C10 mina 0 C►SobrenedantFIG. 2iu mi.ASPECTES TEORICS DE L'ANALISI DE SATURACIOANALISI DE PROGESTERONA EN PLASMA7Vegern ara l'aplicacio de la tecnica del PCB a la determinacio de pro-gesterona en sang.MURPHY, l'any 1967, descrivf un metode que semblava que feia possi-bles les determinacions a gran escala, perb la necessitat d'intercalar-hi unacromatografia en capa fina presentava dificultats per interferencia de fac-tors derivats de les mateixes lamines de la capa.175 ng BH375 I plasma100 ml H2O destil-lada1 5 IUng. progesteronaFIG. 3Fou MURPHY mateix qui puntualitza que, triant convenientment Peterde petroli, horn podia extreure, practicament, tota la progesterona delspossibles esteroides plasmatics que tinguessin tambe una elevada afinitatamb la transcortina.El metode simplificat que presentem en la figura 2, fou posat a puntper JOHANSSON Cl 1969.8i8 F. RIVERA I R. CASADIITJANAUn punt critic del metode resideix en 1'extraccio' i, per aixo, es fona-mental 1'elecci6 de Peter de petroli. Aquest dissolvent no ha de separartotes les proteines del plasma unides a la progesterona, perque aixi s'alli-berarien altres esteroides durant 1'extracci6, la presencia dels quals false-jaria la determninaci6 final de la progesterona.Un altre punt critic de 1'analisi sorgeix en el moment de separar laprogesterona lliure de la que cs unida a proteina; al principi foren utilit-zades, per a la separaci6, columnes de Sephadex, pero els resultats forenenganyosos, puix que aquest material ofereix una baixa afinitat amb lesproteines i aleshores, a causa d'aixb, eren alliberats els altres esteroidesquan passaven per la columna. En el nostre metode emprem el Florisil,substancia insoluble que absorbeix la fraccio lliure de progesterona.La soluci6 CGB-H' es una mescla de 17,5 ng de corticosterona-m,2 H',d'una activitat especifica de 50 Ci/mM i 75 1 de plasma dissolts en moo mld'aigua destil-lada.El metode pot revelar la presencia fins de 0,5 ng/ml, si emprem 0,25 mlde plasma, i fins de 0,3 ng/ml, si la quantitat de plasma es de 0,5 ml.Podem passar ara a la consideraci6 de les corbes standard que ens ser-viran per a donar la valoracio quantitativa de 1'esteroide que volenl mesu-rar. Aquestes corbes (vegeu la figura 3) han d'esser fetes sempre per du-plicitat.La corba I procedeix de les determinacions fetes amb una solucio deCBG-H3 acabada de preparar, mentre que a la 2 la solucio havia romas ala nevera cinc dies.El CPM lligat s6n comptatges per minut de corticosterona que romanunida a la proteina. Aquest recompte es mes elevat com mes petita es laquantitat d'hormona present en el plasma.Veiem com en el segon cas el pendent de la corba disminueix i coin,per tant, disminueix 1'exactitud dell calculs.BIBLIOGRAFIA1. JoHANSSON, E. D. B.: Progesterone levels in peripheral plasma during the lutealphase of the normal human menstrual cycle measured by a rapid competitiveprotein binding tecnique. nActa Endocrinologicau, 61: r1g2-6or (igbq).2. JoHANSSON, E. D. B.: Plasma levels of progesterone in pregnancy measured by arapid competitive protein binding technique. aActa Endocrinologicaa, 61: 607-617 (1gG()•3. JOHANSSON, E. D. B. : A simplifiedprocedure for the assay of progesterone. aKaro-linska Symposia on research methods in reproductive endocrinology. 2nd Sym-posium. Steroid Assay by Protein Bindings (1970).4. JOHANSSON, E. D. B.: A rapid competitive protein binding method for progeste-rone. ((Proceedings of the third international congress on hormonal steroids.Excerpta medical). 264, Amsterdam (1971).82ASPECTES TEORICS DE L'ANALISI DE SATURACI6 95. LIPSSET, M. B., DOERR , P. i BERMIIDEZ , J. A.: Saturation assays for Plasma pro-gesterone and 17-hidroxyprogesterone. ((Karolinska symposia on research methodsin reproductive endocrinology. 2nd Symposium. Steroid assay by Protein Binding))(1970).6. MURPHY, B. E. P.: Protein binding and the assay of nonantigenic hormones. ((Re-cents. Progr. Hormo. Rese.)), 25: 56,1 (1929).7. MURPHY, B. E. P.: Methodological problems in competitive protein-bending tech-niques; the cese of Sephadex colum chromatography to separate steroids. ((ActaEndocrinologica. Suplcmentum)), 147: 37 (1970).8 REEVES , B. D., DE SOUZA, M. L. A., THOMPSON, I. E. i DICZFALUSY, E.: An im-proved method for the assay of progesterone by Competitive Protein Binding.((Acta Endocrinologica)), 63: 225-241 (1970).9. YALOW, R. S. i BERGSON, S. H.: Fundamental principles of radioin muno -assay tech-niques in measurement of hormones. ((Recent advances in endocrinology. Ex-cerpta mcdica)), 16 (1971).10. Yosulnu, T. i LIPSSET, M. B.: The measurement of plasma progesterone. ((Ste.roids), 2: 4 (1968).83

Aspectes teòrics de l'anàlisi de saturació. Aplicació d'aquesta a la determinació de progesterona

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Hemeroteca Cientifica Catalana