Blazsó, Péter Gábor

Hungarian

Blazsó Péter Gábor

SZTE  Doktori Értekezések Repozitórium (SZTE Repository of Dissertations)

A ciklin C promóter működésénekjellegzetességei emlősökbenPh. D. értekezés téziseiDr. Blazsó Péter GáborTémavezető:Dr. Katona Róberttudományos főmunkatársMTA SZBK Genetikai IntézetBiológia Doktori IskolaSZTE TTIK2011.SzegedBevezetésA ciklin  C (CCNC) az  állatvilágban  egy rendkívüli  mértékű  szerkezeti  konzerváltságot  mutató ciklin,  amelyet  nagyfokú  pleiotrópia  jellemez.  A sejtciklus,  a  génátírás  és  a  sejt-sejt  kapcsolat szabályozásában  vesz  részt.  Ciklin-függő  szerin-treonin  kinázokhoz  kötődve,  azokat  aktiválva heterodimer enzimkomplexeket képez. Sejtbiológiai működését az érintett biokémiai útvonalakban való  részvételén,  illetve  fehérjepartnerein  keresztül  lehet  leginkább  jellemezni.  A  sejtciklus szabályozásban eddig  két  ismert  molekuláris  mechanizmussal  vesz  részt.  A ciklin  C kötődik  a CDK2  enzimhez,  amellyel  együttesen  az  LSF  (late  Simian  vacuolating  virus  40 factor) transzkripciós faktor 309. szerinjének foszforilációjával meggátolja ezt a fehérjét abban, hogy a G1 fázisban  indukáljon  jellemzően  S-fázis  géneket.  A  CCNC/CDK3  enzimkomplex  a  pRb (Retinoblastoma) 807/811-es szerinjeinek foszforilálásán keresztül az E2F (adenovirus E2 promoter factor)  pRb-ről  történő leválasztásával,  azaz aktiválásával  indirekt  módon hozzájárul  a  sejtek S fázisba léptetéséhez. Ennek eredményeképp úgy változik meg a sejt génexpressziós profilja, hogy a sejtciklus  továbbhaladhasson  a  G0/G1/S  átmenetben.  A ciklin  C  a  génátírás  egyes  lépéseit  is serkentheti,  illetve  gátolhatja.  Ezeket  a  hatásait  leginkább  a  CDK8  kináz  partnerével  együtt többnyire  egy RNS átírást  szabályozó  ún.  Mediator  komplexnek  a  CDK alegységében fejti  ki. Ismert,  hogy a CCNC/CDK8 enzim foszforilálja az RNS polimeráz II CTD (karboxi terminális domén) régiójában a Ser-2 és Ser-5 aminosavakat, a TFIIH (általános transzkripciós faktor IIH) ciklin  H  alegységének  5-ös  és  304-es  szerinjeit  valamint  a  Notch  ICD  komponensét  is  képes hiperfoszforilálni. Ezeken kívül a ciklin C kináz partnertől független módon, a c-Myc fehérjével együttműködve  elősegíti  a  sejt-sejt  kapcsolatok  kialakítását,  amelynek  hátterében  a VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) és a VLA-4 (very late antigen 4) integrinek egymástól független aktivációja áll. A génátírás, a sejtciklus valamint a sejtadhézió szabályozása alapvető részeit képzik az egyedfejlődési programoknak. Egyre több direkt és indirekt bizonyíték lát napvilágot, amelyek 2mind jobban hangsúlyozzák a CCNC jelentőségét az eukarióta szervezetek egyedfejlődésében is. A sejtes  nyálkapenész  (Dictyostelium  discoideum)  korai  fejlődési,  sejtsors  meghatározási folyamatainak időzítésében vesz részt.  Drosophila melanogasterben a korai bábállapotból történő továbbhaladásnál  létfontosságú  a  CCNC  jelenléte,  illetve  házi  egérben  (Mus  musculus)  is  az embrionális fejlődés kezdeti szakaszában, feltehetően sejtsorsok meghatározásában játszik közre. A ciklin C szöveti/szervi szinten betöltött szerepéről még keveset tudunk. Ahhoz, hogy részleteiben is  feltárhassuk a  ciklin  C fehérjének  ezen funkcióit,  szükség van arra,  hogy az  idő-  és  térbeli kifejeződését követni tudjuk. Ezen túlmenően azon tényezők azonosítása is szükséges, amelyek a CCNC  gén  expressziójára  hatást  gyakorolnak.  Emberi  sejtkultúrákon,  in  vitro kísérletekben bemutatták, hogy a D3 vitamin, transz retinsav, illetve a cAMP (ciklikus adenozin monofoszfát) a megfelelő sejtmagi elemeiken keresztül a CCNC promóteréhez kötődve befolyásolják a gén átírását. Azt is  tudjuk, hogy ezek az elemek jobbára a  ciklin C promóter első 3 kilobázisnyi  szakaszán keresztül  hatnak,  de  azt  nem,  hogy  ez  a  DNS  fragment  elegendő-e  emlősökben  a  ciklin  C kifejeződésének teljes,  élettani  szabályozásához.  Nem ismert  az  sem,  hogy milyen más  elemek játszhatnak még közre.3Célkitűzések1. Azonosíthatók-e olyan újabb részei  a  CCNC promóternek,  amelyek befolyásolják a  gén átírását emlős sejtekben?2. Az egér CCNC transzlációs startpontja mellett 5' irányban levő 3,6 kilobázis hosszúságú DNS szakasz, amely 3,4 kb promóterdarabból és 173 bázispárnyi 5'UTR-ből (untranslated region) áll,  elegendő-e ahhoz, hogy a ciklin C-re jellemző térbeli  expressziós mintázatot kialakítsa?3. Felhasználható-e ez a DNS szakasz egy riporter rendszerben a ciklin C expresszió térbeli és időbeli követésére?4. Felnőtt egerekben milyen a ciklin C1 és C2 térbeli transzkripciós mintázata és ez össze-vethető-e az emberivel valamint a jelzőgén által kialakított mintázattal?Ahhoz,  hogy ezen kérdésekre  válaszokat  kapjunk,  az  egér  CCNC transzlációs  startpontjával  5' irányban  szomszédos,  különböző  hosszúságú  DNS  szakaszokat  építettünk  össze  a  hrGFP jelzőgénnel.  Ezután  ezen  jelzőgén  konstrukciók  kifejeződését  vizsgáltuk  meg  in  vitro emlős sejtekben, illetve in vivo transzgenikus egérmodellben.4Alkalmazott módszerek1. Jelzőgén konstrukciók készítése (plazmid DNS tisztítás,  restrikciós  endonukleáz kezelés, agaróz  gélelektroforézis,  DNS  fragment  tisztítás,  ligálás,  baktérium  transzformáció  és növesztés szelektív táptalajon, DNS szekvencia tervezés és illesztés szoftverrel).2. Emlős sejtkultúrák fenntartása és transzfekciója in vitro.3. Transzgenikus  egérmodell  előállítása (hím egerek  vazektomizálása és  álterhes  nőstények előállítása,  élő  zigóták  kinyerése  vemhes  nőstény  egerekből  és  in  vitro injektálása mikromanipulátorral, embrió transzfer álterhes nőstény egerek petevezetőjébe).4. Genomikus DNS tisztítás egér farokból.5. Polimeráz láncreakció, primer tervezés és optimalizálás.6. Southern hibridizáció (alkalikus transzfer DNS kötő membránra, radioaktív izotóppal jelölt próba előállítása, DNS-DNS hibridizáció, radioaktív jel rögzítés és előhívás).7. Fluoreszcens  in situ hibridizáció (metafázisos kromoszómapreparátumok készítése lépből kinyert egér fehérvérsejtekből, DNS-DNS hibridizáció, immunjelölés és jelerősítés).8. RNS tisztítás egér szervekből és minőségellenőrzés.9. Reverz  transzkripcióhoz  kapcsolt  kvantitatív  valósidejű  PCR  (RNS-ek  DNáz  kezelése, cDNS szintézis, qPCR).10. Fehérje kinyerés egér szervekből és immunoblotting.11. Fluoreszcens mikroszkópia, digitális fényképezés és képfeldolgozás.12. Transzkripciós faktor kötőhely keresés JASPAR szoftverrel.5Eredmények és következtetésekMunkánk során bebizonyítottuk,  hogy az egér ciklin C promóterének első 3,4 és 10,4 kilobázis méretű  szakaszai  az  5'UTR  1-173  nukleotidjaival  képesek  emlős  sejtekben  génkifejeződést kiváltani. Ezzel szemben a promóter első 58 bázispáros darabjának az 5'UTR-rel együttes hiánya jelentősen,  azaz  az  észlelési  küszöb  alá  csökkenti  az  expressziót.  Leginkább  a  proximális promóterszakasz  (és  nem  az  5'UTR)  hiánya  állhat  ennek  a  jelenségnek  a  hátterében,  mert feltételezésünk szerint az RNS polimeráz II kötődhet le ebben a régióban, bár ezt kísérletesen nem vizsgáltuk.  Eredeti  törekvésünk  arra  irányult,  hogy  egérmodellben  egy  jelzőgénnel  egyszerűen tudjuk  követni  a  ciklin  C  tér-  és  időbeli  génkifejeződését.  Ennek  érdekében  az  előzetesen sejtkultúrákban  is  kipróbált  3,4  kb  hosszúságú  ciklin  C  promóterdarabot  és  5'UTR-t  egyszerre tartalmazó jelzőgén konstrukcióval, azaz P3CG-vel négy különböző homozigóta transzgenikus egér vonalat állítottunk elő. A transzgenikus egerek vizsgálata során kiderült, hogy az eredetileg kitűzött célra  nem alkalmasak.  A jelzőgén  kifejeződése  nagyon  gyenge  és  hírvivő  RNS-ének  átírása  is következetesen leginkább csak a herére korlátozódik. Ezzel szemben a ciklin C1 és C2 izoformák RNS expressziója kimutatható az összes általunk vizsgált szervdarabban, csakúgy, mint a felnőtt emberek  szervmintáiban is.  Mindezekből  az  is  következik,  hogy a  ciklin  C térbeli  expressziós szabályozásában  az  izolált  promóterszakaszon  kívül  más  komponensek  is  részt  vesznek.  Ezen túlmenően  kimutattuk,  hogy  az  egér  CCNC  promóterének  első  3,4  kilobázisnyi  szekvenciája tartalmaz CRE motívumokat. Az emberi ciklin C gén promóterének első 3 kilobázisnyi szakaszán is azonosítottak négy működő CRE-t. Mivel korábban a here specifitást mutató promóterekről leírták azt is, hogy a többi promóterhez képest több CRE helyet tartalmaznak, így feltételezzük, hogy a herében a CCNC expressziójának fenntartásához is a CRE kötő transzkripciós faktorok jelentősen hozzájárulnak. Összességében, a bemutatott eredmények felvetik a ciklin C herére jellemző egyedi, eddig még ismeretlen szerepét.6KöszönetnyilvánításLegelőször  szeretném  külön  köszönetemet  kifejezni  témavezetőmnek,  Dr.  Katona  Róbertnek, hogy vállalkozott arra, hogy az elmúlt évek során lelkiismeretes, precíz és segítőkész mentorom legyen a molekuláris biológiai kutatómunkában. Nagyon sokat tanultam tőle. Mindig számíthattam rá és a széleskörű tudására szakmai és nem szakmai kérdésekben egyaránt.Köszönet  illeti  Prof.  Dr.  Hadlaczky  Gyulát és  Prof.  Dr.  Udvardy  Andort,  hogy  munkámat támogatta, figyelemmel kísérte és jobbító kritikáival, tanácsaival ellátott. Hálával tartozom még Dr. Sinkó  Ildikó kolléganőmnek,  akinek  embriológiával  és  egerekkel  kapcsolatos  tudásából  és tapasztalatából  nagyot  meríthettem  valamint  jelenlegi  és  volt  munkatársaimnak,  Dr.  Cserpán Imrének, Dr. Csonka Erikának, Dr. Fodor Katalinnak, Dr. Praznovszky Tündének, Dr. Tubak Vilmosnak,  Ékes Csabának és  Tóth Annának, hogy mindig a segítségemre voltak, ha tanácsra, információra,  reagensre  vagy valamilyen  eszközre  volt  szükségem és  ha  elakadtam valamiben. Hálás vagyok a csoport többi tagjának, Horváth Csillának,  Katonáné Székely-Szűcs Kingának, Kereső Juditnak,  Mózesné Holló Gyöngyinek,  Odrovics Balázsnak és  Rózsavölgyi Mártának is,  hogy segítettek  a  kísérletek  kivitelezésénél  valamint  Deák Mária,  Kasza  György, Kovács Tímea,  Márfai József,  Veres Erika és az állatházi dolgozók munkájáért, amivel lehetővé tették, hogy a kutatómunkára összpontosíthassak.Szeretném  még  itt  megköszönni  Prof.  Dr.  Raskó  Istvánnak és  kutatócsoportjának,  hogy egyetemi hallgatóként és újonc doktoranduszként közelebbről is megismerkedhettem a tudományos kutatással.Hálás vagyok még Dr. Czibula Ágnesnek, Dr. Hegedűs Zoltánnak, Dr. Lipinszki Zoltánnak, Dr. Márkus Róbertnek, Dr. Monostori Évának és  kutatócsoportjának,  Dr. Sepp Róbertnek,  Dr. Vizler Csabának, Winter Zoltánnak és Zsámboki Jánosnak a gyümölcsöző együttműködésekért 7valamint az MTA SZBK Genetikai Intézet valamennyi dolgozójának, hogy a szakmai fejlődést támogató közegben dolgozhattam.Utoljára, de nem utolsósorban köszönet illeti meg szüleimet és testvéremet, akikre életem minden területén támaszkodhattam és közvetett vagy közvetlen segítségükkel is nagyban segítették szakmai előrehaladásomat.Hálás vagyok még a  nyílt forráskódú szoftveres közösség fejlesztőinek és  tagjainak is,  hogy munkám  során  nem  kellett  pénzt  költsek  értékes  operációs  rendszerre  (Ubuntu  Linux),  irodai (OpenOffice.org,  LibreOffice)  és  grafikai  programokra  (GIMP),  hanem  azokat  szabadon  és jogtisztán letölthettem és felhasználhattam.KözleményekFolyóirat   közlemények 1. Blazsó P. Cyclin C and the development of mice. (dissertation summary) ACTA BIOL SZEGED 51(2):140. (2007)2. Katona RL, Sinko I, Hollo G, Szucs KS, Praznovszky T, Kereso J, Csonka E, Fodor K, Cserpan I, Szakal B, Blazso P, Udvardy A, Hadlaczky G. A combined artificial chromosome-stem cell therapy method in a model experiment aimed at the treatment of Krabbe's disease in the Twitcher mouse. CELL MOL LIFE SCI 65:(23) 3830-3838 (2008) IF: 5.5113. Blazsó P, Sinkó I, Praznovszky T, Hadlaczky G, Katona RL. 3.6-kb mouse cyclin C promoter fragment is predominantly active in the testis. ACTA BIOL HUNG 63:(1), közlésre elfogadva (2012). IF: 0.551KönyvfejezetBlazso P,  Sinko  I,  Katona  R.  Engineered  chromosomes  in  transgenics.  Mammalian Chromosome Engineering. Methods in Molecular Biology, Vol. 738. ISBN: 978-1-61779-098-08SzabadalomUher  Ferenc,  Monostori  Éva,  Joó  Gabriella,  Krenács  László,  Szebeni  Gábor,  Martinek Tamás,  Tubak  Vilmos,  Blazsó  Péter,  Katona  Róbert,  Kovács  Sólyom  Ferenc,  Blaskó Andrea, Gercsó András Tiborné, Fajka-Boja Roberta. Készítmény, hatóanyagok bejuttatására szolid tumorokba. Ügyszám: P0900502. Bejelentve: 2009.08.11., Közzétéve: 2011.03.28.Előadások1. Blazsó P, Sepp R, Polgár N, Rácz P, Pálinkás A, Mogensen J, McKenna WJ, Csanády M, Forster T. A troponin I gén mutációanalízise hypertrophiás cardiomyopathiában. A Magyar Kardiológusok Társaságának 2003 évi Tudományos Ülése. Balatonfüred, 2003. május 14-17.2. Polgár N, Sepp R, Rácz P,  Blazsó P,  Dongó Á, Jebelovszki É, Pálinkás A, Csanády M, Forster T. A béta myozin nehéz lánc gén mutációanalízise dilatatív cardiomyopathiában. A Magyar  Kardiológusok  Társaságának  2003  évi  Tudományos  Ülése.  Balatonfüred,  2003. május 14-17.3. Rácz P, Sepp R, Blazsó P, Polgár N, Pálinkás A, Mogensen J, McKenna WJ, Csanády M, Forster  T.  A troponin  T  gén  mutációelemzése  magyar  hypertrophiás  cardiomyopathiás betegekben.  A  Magyar  Kardiológusok  Társaságának  2003  évi  Tudományos  Ülése. Balatonfüred, 2003. május 14-17.4. Sepp R, Blazsó P, Pálinkás A, Jebelovszki É, Dongó Á, Anastasakis A, Raskó I, Csanády M, Forster  T.  Fenotípus  specifikus  mutációanalízis  hypertrophiás  cardiomyopathiában.  A Magyar  Kardiológusok  Társaságának  2003  évi  Tudományos  Ülése.  Balatonfüred,  2003. május 14-17.5. Csanády M, Sepp R, Blazsó P, Rácz P, Dongó Á, Jebelovszky É, Pálinkás A, Forster T. Low prevalence  of  beta  myosin  heavy  chain  gene  mutations  in  Hungarian  patients  with hypertrophic cardiomyopathy. 64th Congress of the Italian Cardiac Society, 2003. December 6-10, Rome, Italy.6. Blazsó P, Sepp R, Jebelovszki É, Pálinkás A, Forster T, Csanády M. A troponin T és I gének mutációanalízise hypertrophiás cardiomyopathiában. Tudomány Napjai, Szegedi Akadémiai Bizottság. Szeged, 2004. október 3.7. Blazsó P, Sepp R, Pálinkás A, Jebelovszki É, Anastasakis A, Raskó I, Csanády M, Forster T. Fenotípus  specifikus  mutációanalízis  hypertrophiás  cardiomyopathiában.  Magyar Humángenetikusok V. Munkakonferenciája. Szeged, 2004. november 11-13.8. Sepp R, Csanády M, Blazsó P, Pálinkás A, Jebelovszky É, Anastasakis A, Raskó I, Forster T. Mutációanalízis hypertrophiás cardiomyopathiában. VI. Magyar Genetikai Kongresszus és XIII. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok. Eger, 2005. április 10-12.99. Katona R, Sinkó I, Praznovszky T, Mózesné H Gy, Katonáné Sz Sz K, Kereső J, Csonka E, Fodor K, Cserpán I, Udvardy A, Blazsó P, Ékes Cs, Rózsvölgyi M, Novák I és Hadlaczky Gy.  Lehet-e  gyógyítani  emlős  mesterséges  kromoszómával?  VII.  Magyar  Genetikai Kongresszus és XIV. Sejt- és Fejlődésbiológiai Napok. Balatonfüred, 2007. április 15-17.10. Robert  Katona,  Ildiko  Sinko,  Tunde  Praznovszky,  Erika  Csonka,  Katalin  Fodor,  Imre Cserpan,  Peter  Blazso,  Andor  Udvardy  and  Gyula  Hadlaczky:  A Combined  Artificial Chromosome-Stem Cell  Therapy Method  for  the  Treatment  of  Krabbe's  Disease  in  the Twitcher Mouse. 2nd International Conference on Drug Discovery and Therapy, February 1st - 4th, 2010, Dubai, UAE11. Szebeni Gábor János, Kriston-Pál Éva,  Blazsó Péter, Katona Róbert, Joó Gabriella, Uher Ferenc, Krenács László, Blaskó Andrea, Fajka-Boja Roberta, Vizler Csaba, Monostori Éva: A  mesenchymalis  őssejtekben  termelődő  galektin-1  alapvetően  szabályozza  a mesenchymalis őssejtek tumor fejlődést serkentő hatását. A Magyar Immunológiai Társaság XXXIX. Vándorgyűlése, 2010. november 3., Szeged12. Fajka-Boja Roberta, Blaskó Andrea, Czibula Ágnes, Szebeni Gábor János,  Blazsó Péter, Katona  Róbert,  Hegyi  Beáta,  Uher  Ferenc,  Monostori  Éva:  A  galektin-1  termelés befolyásolja a mesenchymális őssejtek limfocita proliferáció-szabályozó hatását. A Magyar Immunológiai Társaság XXXIX. Vándorgyűlése, 2010. november 3., Szeged13. Blazsó Péter, Sinkó Ildikó, Praznovszky Tünde, Hadlaczky Gyula, Katona Róbert: Az egér ciklin C promóter 3.6 kb szakasza a jelzőgén here specifikus átírását idézi elő. IX. Magyar Genetikai  Kongresszus  és  XVI.  Sejt-  és  Fejlődésbiológiai  Napok,  2011.  március  25-27., SiófokPoszterek1. Szabó Enikő, Czibula Ágnes,  Blazsó Péter, Katona Róbert, Uher Ferenc, Monostori Éva: Csontvelői  eredetű  mesenchymális  őssejtek  klónozása  az  MSC  sejtpopuláció heterogenitásának  vizsgálatához.  A  Magyar  Immunológiai  Társaság  XXXIX. Vándorgyűlése, 2010. november 3., Szeged2. Péter  Blazsó,  Ildikó  Sinkó,  Tünde  Praznovszky,  Imre  Cserpán,  Erika  Csonka,  Katalin Fodor, Anna Tóth, Andor Udvardy, Gyula Hadlaczky, Róbert Katona: Organ specific hrGFP expression driven by a  3.5kb cyclin  C promoter  fragment  in the mouse.  December 1-2, 2010., Straub Days, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences, Szeged10

A ciklin C promóter működésének jellegzetességei emlősökben

http://doktori.bibl.u-szeged.hu/843/1/PhD-ertekezes-BP-final.pdf

A ciklin C promóter működésének jellegzetességei emlősökben

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

SZTE Doktori Értekezések Repozitórium (SZTE Repository of Dissertations)