Purification and Characterization of Membrane Proteins: Beef Heart Mitochondrial Succinate Dehydrogenase

Abstract

Beef heart succinate dehydrogenase (SDH) was solubilized from mitochondrial membranes by a medium containing 4% Triton X-100/4M urea ipH8.6). It was subsequently purified to homogeneity via ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose CL-6B and gel filtration on BioGel A-O.Sm. The pure SDH preparation had a specific activity of 14 - 15.5u moles succinateoxidized/min/mg biuret protein at 38°C in the ferricyanide reductase assay. The pure SDH was composed of two polypeptide subunits (30k and 70k) present at a molar ratio of 1. The N-terminal amino acid residue of the 70k subunit was found to be isoleucine whereas the 30k subunit may have a blocked N-terminal amino acid. Analytical polyacrylamide gel electrophoresis demonstrated that the pure SDH preparation (detergent-free) was not present in an aggregated form. The Triton-free protein had a hydrodynamic molecular weight of 105,000 daltons and a partial specific volume of 0.74ml/g as determined by sedimentation equilibrium ultracentrifugation. […]La déhydrogénase de succinate du muscle cardiaque bovin a été solubilisée des membranes de la mitochondrie dans un milieu contenant 4% Triton X-100/4H urée (pH8.6). L'enzyme fut purifiée à l'état homogène par la chromatographie a échange d'ions (DEAE Sepharose CL-6B) et la chromatographie sur gel (BioGel A-0.5m). La préparation ainsi purifiée avait une activité spécifique de 14 - 15.5u moles succinate oxydée/min/mg protéine a 38°C dans l'essai de la réductase de ferricyanure. La protéine purifiée était composée de deux sous-unités polypeptidiques (30k et 70k) qui étaient présents dans un rapport de 1 à 1. L'acide aminé N-terminal du sous-unité de 70k se trouve à être l'isoleucine tandis que celui du 30k est bloqué. Aucune aggrégation était apparente quand la molécule (sans détergent) fut examinée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. L'ultra centrifugation à équilibre révéla que la protéine (ne contenant aucun détergent) avait un poids moléculaire hydrodynamique de 105,000 daltons et un volume spécifique partiel de 0.74ml/g. […