Kobayashi, Amane

コバヤシ, アマネ

小林, 周

KeiO Academic Resource Archive

  
 
 
 
 
 
 
 
         
 
ＸＦＥＬコヒーレント回折イメージング実験手法の開発と 
細胞イメージングへの応用 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
平成 29年度 
 
 
 
 
小林 周 
 
 
  
 
１ページ目：博士論文 表 紙記入例 
２ページ目：博士論文 背表紙記入例 
３ページ目：博士論文 中表紙記入例 
別表５ 
  (3) 
 主 論 文 要 旨 No.1 
    
報告番号 甲 乙 第      号 氏 名 小林 周 
 
主論文 題名 ： 
 XFEL コヒーレント回折イメージング実験手法の開発と細胞イメージングへの応用 
 
 
 
（内容の要旨） 
生物の最も基本的な単位である細胞は、細胞核や葉緑体といった細胞小器官をもっており、さらにその
内外には膨大な水分子と共にタンパク質や核酸、脂質など生体分子を含んでいる。これらは μm から nm
の複雑な空間階層構造を有しており、その機能構造を真に理解するためには、細胞丸ごとを空間階層に隔
たりなく可視化する必要がある。コヒーレント X 線回折イメージング(Coherent X-ray diffraction 
Imaging: CXDI)は、μmサイズの非結晶試料を数十nm分解能で解析することが可能で、これまで電子顕
微鏡と光学顕微鏡による解析が困難であった空間階層領域の橋渡しをする構造解析手法として期待されて
いる。 
CXDI 実験では、試料に空間コヒーレンスの高いX線を入射して得られる回折パターンに位相回復法を
適用し、X線入射方向に対する投影電子密度像を回復する。X線自由電子レーザ (ーX-ray free electron laser: 
XFEL)は、超高輝度かつ超短パルス光源であるため、CXDI 実験の入射光源として理想的であり、パルス
1 ショットで、放射線損傷のない構造を回折パターンとして記録できる。しかし、照射後に試料はクーロ
ン爆発を起こして破壊されるので、同一試料から複数の回折パターンを取得することは不可能であり、ト
モグラフィーによって三次元電子密度分布を可視化することはできない。近年、計算機実験において、同
一の試料であるが異なる個体の投影電子密度像から三次元構造を回復できることが示された[Kodama & 
Nakasako., Phys. Rev. E 84, 021902 (2011)]。しかしながら、この手法を適用するためには膨大量の回折
パターンを計測する必要があった。 
研究室では、真空環境下で多数の試料粒子を散布した薄膜をXFELパルス毎に並進させ、新鮮な試料を
照射野に連続的に提供する実験方式を採用しているため、並進速度及び試料の交換効率が回折パターン取
得効率を左右する。加えて真空中で、水和環境が必須である細胞試料の機能構造を維持しなければならな
い。また、XFELを用いたCXDI実験では、ビームストッパーや検出器の飽和により回折パターンの極小
角領域にデータ欠損が生じる。極小角領域は、試料概形に関する情報を含むため、像回復効率が低下する
ことがしばしばであった。 
回折パターン計測効率を向上させるために高速並進ステージが実装されたクライオ試料固定照射装置の
利用において、同装置の制御ソフトウェアの開発と細胞試料を凍結水和状態とする試料調整手法を確立す
ることで、およそ80時間で90~160万枚の回折パターンを取得できるようになった。質の高い回折パター
ンからは、シアノバクテリアや酵母の細胞核の投影電子密度像が~100 nmの分解能で得られた。また、回
折パターンの中心対称性を考慮した新規暗視野位相回復法を開発することにより、極小角領域を大きく欠
損した回折パターンにおいても像回復が可能となることを示した。これらの計測・解析技術を用いて細胞
や細胞小器官の投影電子密度像が大量に得られるようになった。本研究ではこれらをシアノバクテリアの
三次元構造解析に適用した。 
 
 
別表６ 
（３）                                    Keio University 
 
Thesis Abstract 
 No.      
Registration 
Number 
☑ “KOU”   □ “OTSU” 
No.        *Office use only 
Name Amane Kobayashi 
Thesis Title 
Development of measurement techniques in coherent X-ray diffraction imaging utilizing XFEL and its 
application for imaging biological cells 
 
Thesis Summary 
Biological cell is a basic unit of all known living organisms, and are composed of cellular organelles such as a nucleus, a 
chloroplast, and so on. Inside and outside the organelles, there are numerous numbers of biological molecules such as proteins, 
nucleic acids, and lipids, which are immersed in water. Biological cells have complicated and hierarchical structures with resolution 
range from micrometer to nanometer. One of ultimate goals of cell biology is the visualization of whole structures of cells at a 
resolution without gaps between the spatial hierarchies. Coherent X-ray diffraction imaging (CXDI) has the potential to visualize 
whole cellular structures at a resolution of a few tens of nanometers, and is expected to bridge the resolution gaps inaccessible for 
both light microscopy and transmission electron microscopy. 
In CXDI experiments, an isolated specimen particle is irradiated by an X-ray beam with high transverse coherence. From the 
Fraunhofer diffraction pattern recorded by an area detector, the electron density map of the particle projected along the direction of 
incident X-ray is reconstructed by using the phase-retrieval algorithms. Recently, X-ray free electron laser (XFEL) sources, which 
provide very intense X-rays with almost coherent pulses at the duration of tens fs, have been utilized in CXDI experiments. 
However, single XFEL pulses destroy the specimen particles at the atomic level through the Coulomb explosion after the diffraction 
from the particles occurs. Therefore, it is impossible to visualize a three-dimensional (3D) electron density map from one specimen 
particle by tomography experiments. In recent years, a protocol was proposed for reconstructing the 3D electron density map from a 
number of projection electron density maps of particles in various orientations against the directions of incident X-ray beams 
[Kodama & Nakasako, Phys. Rev. E 84, 021902 (2011)]. Toward utilizing the method, a huge number of diffraction patterns must be 
efficiently collected in CXDI experiments using XFEL pulses (XFEL-CXDI). 
In our Laboratory, we developed a diffractometer with a high-speed translation stage to provide fresh specimen particles into 
the irradiation area by raster scan against trains of XFEL pulses under vacuum condition. To enable the collection of a huge number 
of diffraction patterns, the author developed the motion control and scheduling software of the diffractometer. In addition, to keep 
functional structures of biological specimens in the vacuum environment, the author developed methods for preparing 
frozen-hydrated biological specimens. As a result, these developments allow us to collect 0.9~1.6 million diffraction patterns within 
80 hours. From the high quality diffraction patterns, the projection structures of biological specimens, such as cyanobacterial cells 
and nuclei of yeast, were visualized at resolutions of ~100 nm. Furthermore, to efficiently reconstruct electron density maps from 
diffraction patterns missing data in the small-angle regions due to a beam stopper and the saturation of the area detector, the author 
proposed a phase-retrieval method using the Friedel centro-symmetry in diffraction patterns as the constraint. These experimental 
and theoretical methods made XFEL-CXDI more effective to visualize the structures of biological cells and cellular organelles. In 
addition, the author applied the XFEL-CXDI methods to 3D structural analyses of cyanobacterial cells. 
 


Development of measurement techniques in coherent X-ray diffraction imaging utilizing XFEL and its application for imaging biological cells

http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/download.php?koara_id=KO50002002-20174861-0002

Development of measurement techniques in coherent X-ray diffraction imaging utilizing XFEL and its application for imaging biological cells

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