Stepanets, Dimitri

Die Infektion mit dem phytopathogenen Pilz Verticillium longisporum induziert eine
entwicklungsphysiologische Reprogrammierung der Wirtspflanze A. thaliana Col-0, welche
eine Transdifferenzierung der chloroplast-haltigen Bündelscheidenzellen zu funktionsfähigen
Xylemelementen zur Folge hat. Zusätzlich resultiert die Wiederaufnahme der kambialen
Aktivität und Transdifferenzierung von Zellen des Xylem-Parenchyms in der sogenannten
Xylem-Hyperplasie. Die Neubildung von Xylemelementen wird durch eine erhöhte Wasser
Speicherkapazität und verbesserte Trockenstresstoleranz V. longisporum infizierter Pflanzen
begleitet (Reusche et al., 2012).
Die Induktion der Xylem-Neubildung ist nicht nur auf V. longisporum beschränkt. In einer
kürzlich durchgeführten Studie wurden die Infektionsphänotypen von 47 V. dahliae Isolaten
auf A. thaliana Col-0 systematisch analysiert. Virulente V. dahliae Isolate fielen in zwei
unterschiedliche Interaktionsklassen, welche deutlich unterscheidbare Infektionsphänotypen
auf A. thaliana auslösten. Fünf V. dahliae Isolate lösten V. longisporum-ähnliche Symptome
aus, die die Xylemneubildung, Größenreduktion der Rosette (das sogennante stunting),
Blattchlorosen und verfrühte Seneszenz umfassen. Im Gegensatz dazu verursachten 36 Isolate
V. dahliae-ähnliche Welke, stunting und das Absterben älterer Blätter (K. Thole, PhD thesis,
2016). Diese klar unterscheidbaren Infektionsphänotypen wurden „Chlorose“ und „Welke“
benannt. Es wurde postuliert, dass diese Infektionsphänotypen durch isolatspezifische
Verticillium Effektoren ausgelöst werden, welche klar unterscheidbare transkriptionelle und
entwicklungsphysiologische Reprogrammierung der Wirtspflanze induzieren (K. Thole, PhD
thesis, 2016). In der durch K. Thole durchgeführten Studie wurden in vergleichenden Analysen
der pilzlichen Genome und Transkriptome einige potenziell sekretierte Effektorkandidaten
identifiziert, die durch V. dahliae Chlorose- und Welke-Isolate in planta differenziell
exprimiert werden. Unter Verwendung der durch K. Thole generierten
RNA-Sequenzierungsdaten wurde in dieser Doktorarbeit eine Analyse des pflanzlichen
Transkriptoms durchgeführt. Dabei sollten differenziell exprimierte Wirtsgene, welche an der
Ausprägung des Chlorose Infektionsphänotyps beteiligt sind, identifiziert werden.
In dieser Transkriptomanalyse wurden N. benthamiana Homologe der Arabidopsis G-type
lectin receptor-like Kinase At5g24080, des NAC Transkriptionsfaktors ANAC071 und des
Dehydrin RD17 als spezifische Chlorose-Isolat induzierte Kandidatengene ausgewählt. Für die
drei Chlorose-Isolat induzierten Gene wurden homozygote Arabidopsis T-DNA
Insertionsmutanten isoliert und im Detail charakterisiert. Die Charakterisierung der rd17
Mutante zeigte, dass die T-DNA Insertion keine Auswirkung auf die RD17 Transkriptmenge hatte. Der Infektionsphänotyp der G-type lectin receptor-like Kinase Mutante und NAC
Transkriptionsfaktor Mutante unterschied sich nicht von dem des Wildtyps. Dies deutet darauf
hin, dass die entsprechenden Gene nicht an der Ausprägung des Chlorose Infektionsphänotyps
beteiligt sind.
Bioinformatische Analysen von öffentlich zugänglichen Mikroarraydaten zeigten, dass einige
Chlorose-Isolat induzierte Gene, unter ihnen die G-type lectin receptor-like Kinase At5g24080,
Abscisinsäure (ABA) responsiv sind. In quantitativen PCR bzw. Immunoblot Analysen
akkumulierten At5g24080 Trankripte sowie das AT5G24080-Venus Fusionsprotein nach
exogener Gabe von ABA. In der aba1-101 ABA Biosynthesemutante war die Expression von
At5g24080 während der Infektion mit einem Verticillium Chlorose-Isolat reduziert.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ABA zu der transkriptionellen
Reprogramierung während der Chlorose-Isolat Infektion beiträgt.
Um diese Hypothese zu prüfen, wurde die Arabidopsis ABA Biosynthesemutante aba1-101 im
Hinblick auf die nach der Infektion mit einem Chlorose-Isolat entwickelten Symptome
analysiert. In diesen Experimenten zeigten aba1-101 Pflanzen Welke-ähnliche Symptome
21 Tage nach Infektion, jedoch keine Blattchlorosen und keine verfrühte Seneszenz. Dies weist
darauf hin, dass die ABA Biosynthese der Wirtspflanze für die Ausprägung der Chlorose- und
der verfrühten Seneszenzsymptome notwendig ist. Die Transdifferenzierung von
Bündelscheidenzellen zu Xylemelementen war in der aba1-101 Mutante nicht beeinträchtigt.
Somit ist ABA vermutlich nicht an der Xylemneubildung beteiligt. Zusätzlich waren die
aba1-101 Pflanzen weniger anfällig gegenüber dem V. dahliae Chlorose-Isolat c-V76 im
Vergleich zum Wildtyp. HPLC-MS/MS Analysen zeigten einen starken Anstieg der ABA
Mengen in Verticillium Chlorose-Isolat infizierten A. thaliana Col-0 im Vergleich zur
Mock-Behandlung oder Infektion mit einem Welke-Isolat und unterstützen somit das Konzept,
dass ABA-abhängige (signaltransduktions-) Prozesse in der isolatspezifischen
Symptomausprägung durch Verticillium eine Rolle spielen. Zusammengefasst implizieren diese
Ergebnisse, dass ABA an der transkriptionellen Reprogramierung während der Chlorose-Isolat
Infektion beteiligt ist, welche zur Ausprägung der Chlorose- und der verfrühten
Seneszenzsymptome führt. Außerdem stellt ABA einen Suszeptibilitätsfaktor in der
A. thaliana – Verticillium Chlorose-Isolat Interaktion dar.Verticillium longisporum induces developmental reprogramming of A. thaliana Col-0 leading to transdifferentiation of chloroplast-containing bundle sheath cells to functional xylem elements. Moreover, re-initiation of cambial activity and transdifferentiation of xylem parenchyma cells result in xylem hyperplasia within the Arabidopsis vascular system. The de novo xylem formation is accompanied by enhanced water storage capacity and enhanced drought tolerance of V. longisporum infected plants (Reusche et al., 2012). 
Induction of de novo xylem formation is not restricted to V. longisporum. In a recent study, the interaction phenotypes of A. thaliana Col-0 with 47 V. dahliae isolates were systematically analysed. Virulent V. dahliae isolates fall into two distinct interaction classes, eliciting clearly distinguishable disease phenotypes on A. thaliana. Five V. dahliae isolates were identified which trigger V. longisporum-like symptoms including de novo xylem formation, stunted growth, leaf chlorosis and early senescence. In marked contrast, 36 isolates showed V. dahliae like wilting, stunted growth and decay of older rosette leaves (K. Thole, PhD thesis, 2016). These clearly distinguishable disease phenotypes were designated as “chlorosis” and “wilting”. It was postulated that these disease phenotypes are triggered by lineage specific Verticillium effector molecules which induce distinct transcriptional and developmental reprogramming patterns in the host plant (K. Thole, PhD thesis, 2016). In the study conducted by K. Thole several putatively secreted candidate effectors that are differentially expressed in planta by chlorosis- and wilting-inducing V. dahliae isolates were identified by comparative analyses of the Verticillium genome and transcriptome. Using the RNA-sequencing data generated by K. Thole, in this study a plant transcriptome analysis was performed, aiming at the identification of differentially expressed host genes that may be involved in establishment of the chlorosis disease phenotype in response to putative Verticillium effectors. 
This transcriptome analysis revealed N. benthamiana homologs of Arabidopsis G-type lectin receptor-like kinase At5g24080, NAC domain transcriptional factor ANAC071 and dehydrin RD17 as candidate genes that are highly and specifically induced by chlorosis isolate infection. Consequently, homozygous Arabidopsis T-DNA insertion mutants were isolated for the three chlorosis induced candidate genes and analysed in detail. Characterisation of the rd17 mutant demonstrated that the T-DNA insertion had no effect on RD17 transcript abundance. Disease phenotypes of the G-type lectin receptor-like kinase mutant and NAC domain transcriptional factor mutant were not altered as compared to wild-type, suggesting that corresponding genes are not involved in establishment of the chlorosis disease phenotype. 
In silico analyses of publically available microarray data indicated that a number of chlorosis isolate induced candidate genes, among them the G-type lectin receptor-like kinase At5g24080, are responsive to abscisic acid (ABA). Quantitative PCR and immunoblot analyses demonstrated an increase in At5g24080 transcripts as well as AT5G24080-Venus fusion protein levels after exogenous application of ABA. Furthermore, At5g24080 expression was reduced in the aba1-101 ABA biosynthesis mutant background during Verticillium chlorosis isolate infection. Together these results suggested that ABA might contribute to transcriptional reprogramming during chlorosis isolate infection.
To test this hypothesis, the Arabidopsis ABA biosynthesis mutant aba1-101 was analysed with regard to symptom development established upon infection with a Verticillium chlorosis isolate. These experiments demonstrated wilting-like disease symptoms of aba1-101 mutant plants at 21 days after infection and absence of leaf chlorosis as well as absence of early senescence, indicating that host plant ABA biosynthesis is required for establishment of chlorosis and early senescence symptoms. Notably, bundle sheath cell transdifferentiation was not impaired in the aba1-101 mutant, suggesting that functional ABA biosynthesis is not required for de novo xylem formation. In addition, aba1-101 mutant plants were less susceptible to V. dahliae chlorosis isolate c-V76. HPLC-MS/MS demonstrated that ABA levels are strongly increased in A. thaliana Col-0 during Verticillium chlorosis isolate infection as compared to mock treatment or wilting isolate challenge, supporting the concept that ABA-dependent (signalling) processes are important for Verticillium lineage-specific symptom development. In summary, results of this thesis suggest that ABA contributes to transcriptional reprogramming during chlorosis isolate infection, which leads to establishment of chlorosis and early senescence symptoms. Furthermore, ABA represents a susceptibility factor in A. thaliana -  Verticillium chlorosis isolate interaction.2019-04-0

Georg-August-University Göttingen

Identification of Arabidopsis genes involved in differential interaction phenotype establishment by distinct Verticillium spp. and isolates

https://ediss.uni-goettingen.de/bitstream/11858/00-1735-0000-002E-E3C0-A/1/PhD%20Thesis_Dimitri%20Stepanets_linearized.pdf

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