Il progetto scientifico sviluppato durante il triennio del Dottorato di ricerca ha riguardato lo
studio delle relazioni struttura-funzione della DNA elicasi dall’archaeon iper-termofilo Sulfolobus
solfataricus (SsoMCM).
La replicazione del DNA negli eucarioti è caratterizzata dall’interazione di molti fattori proteici che
coordinano in maniera altamente precisa una serie di eventi culminanti con la duplicazione del
materiale genetico prima del completamento della divisione cellulare. Il completo sequenziamento
del genoma di molte specie archeobatteriche ed i primi studi effettuati sul sistema replicativo di tali organismi indicano l’esistenza di una forte similitudine con il sistema eucariotico. Infatti, i
complessi molecolari degli Archaea coinvolti nella replicazione del DNA sono costituiti da fattori
proteici più simili a quelli eucariotici che non batterici e questo fa degli Archaea un ottimo modello
di studio per comprendere i meccanismi biologici che regolano il complicato macchinario
replicativo eucariotico.
Lo studio dell’ipotetica DNA elicasi replicativa SsoMCM è un perfetto esempio in tal senso. Infatti,
nel genoma di Sulfolobus solfataricus è presente un unico omologo delle proteine che compongono
il complesso proteico MCM 2-7 eucariotico (Mini-Chromosome Maintenance). Studi preliminari
hanno evidenziato che SsoMCM è un omo-esamero ed appartiene alla super-famiglia delle ATPasi
con varie Attività cellulari Associate (AAA+ super-family), è in grado di legare differenti tipi di
molecole di DNA e mostra un’attività DNA elicasica, ATPasi-dipendente, con polarità 3’->5’.
Studi strutturali mediante microscopia elettronica ad elevata risoluzione e cristallografia ai raggi-X della proteina MCM dell’archaeon Methanothermobacter thermoautotrophicum (MthMCM) hanno
dimostrato che essa è costituita da due esameri giustapposti, ciascuno dei quali delimita un canale
centrale carico positivamente che si ritiene leghi il DNA. Grazie all’allineamento tra le sequenze
altamente simili di MthMCM e di SsoMCM, perfezionato sulla base della struttura cristallografica
recentemente risolta di un frammento di circa 300 residui di MthMCM, è stato possibile identificare
aminoacidi con carica positiva di SsoMCM putativamente localizzati nel canale centrale e coinvolti
nel legame al DNA. Tali aminoacidi (Lisine 129, 134, 194 ed Istidina 146) sono stati sostituiti con
residui di Alanina mediante mutagenesi sito-diretta. Si è dimostrato che le proteine mutanti formano
correttamente omo-esameri in soluzione e conservano una attività ATPasica paragonabile a quella
della proteina wild type. Mediante analisi per EMSA e saggi enzimatici è stato possibile dimostrare
che sono critici per il legame al DNA e/o l’attività DNA elicasica, mentre la sostituzione del residuo aminoacidico K134 con Alanina ha effetto solo sul legame al DNA a doppio filamento e non sul
legame al DNA a singolo filamento ne sull’attività DNA elicasica dell’enzima. Grazie alla analisi
suddetta, sono stati individuati altri residui basici (Lisina 246 ed Arginine 247, 250) situati in β-hairpin fingers ipoteticamente orientati verso il canale centrale in SsoMCM. La loro sostituzione
con Alanina determina una sostanziale riduzione sia del legame al DNA che dell’attivita enzimatica.
Inoltre, mediante tecniche di spettroscopia di fluorescenza sono stati monitorati cambi
conformazionali di tali β-hairpin fingers promossi dal legame di SsoMCM a vari nucleotidi (ATP,
ADP, ADP-AlF4-). L’effetto più importante si è osservato quando gli spettri sono stati registrati in
presenza di ADP o ADP-AlF4-, un analogo dello stato di transizione della reazione di idrolisi
dell’ATP. Questi risultati suggeriscono che l’idrolisi, piuttosto che il legame, dell’ATP determina il
movimento di tali elementi di struttura necessario per la funzione di remodeling del DNA da parte
di SsoMCM
