Az UV-sugárzás által károsított DNS Rad6 ubiquitin-konjugáló enzim által irányított, mutációt okozó illetve hibamentes replikációja Saccharomyces cerevisiae-ben = The Rad6 ubiquitin-conjugating enzyme dependent error-free and error-prone translesion DNA synthesis of UV-damaged DNA in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

A környezetünkben jelenlévő és a metabolikusan keletkező reaktív ágensek is folyamatosan károsítják a DNS-t. A kijavítatlan DNS hibáknál elakadt replikációs villa mentésében játszik szerepet a RAD6-RAD18-függő DNS károsodást toleráló mechanizmus, mely hibamentesen vagy mutációt generálva vezethet a károsodott DNS replikációjához. Kutatásunk célja az volt, hogy mélyebb betekintést nyerjünk a Saccharomyces cerevisiae RAD6, RAD18, RAD5, PCNA, UBC13, MMS2, REV7, és REV1 gének szerepére a károsított DNS replikációjában. Fehérje-komplexek kettős affinitás tisztításával és élesztő kettős-hibrid kísérletek segítségével sikerül fizikai kapcsolatokat kimutatnunk a Rev1-Rev7, Rad5-Rad18, Rad5-Ubc13, és a Rad18-PCNA fehérjék között. Az interakciók jelentőségének a megértéséhez a fenti fehérjekomplexeket tisztítottuk majd enzimatikusan jellemeztük, és megvizsgáltuk, hogy melyik fehérje lehet a Rad18 ubiquitin ligáz szubsztrátja. A Rad6-Rad18 enzim-komplex segítségével sikerült a PCNA replikációs fehérjét monoubiquitinálnunk, melynek tisztítása után jellemeztük aktiváló hatását a hibaátíró DNS polimerázok szintetikus aktivitására. Az elért új eredmények alapján elindítottunk egy új kutatási vonalat is, melynek célja az élesztő Rad5 emberi homológjának az azonosítása és jellemzése és a human ubiquitinált PCNA szerepének megismerése a károsított DNS replikációjában. | Genomic DNA is subjected to damage by external environmental agents and endogenous metabolic byproducts. To rescue the replication fork stalled due to encountering unrepaired DNA lesions the RAD6-RAD18-dependent damage avoidance mechanisms have evolved, which can lead to either error-free or error-prone replication of damaged DNA. The goal of our project was to shed more light on the function of Saccharomyces cerevisiae RAD6, RAD18, RAD5, PCNA, UBC13, MMS2, REV7, and REV1 genes in the replication of damaged DNA. With tandem affinity purification of protein complexes, and yeast two-hybrid method, we have detected physical interaction between Rev1-Rev7, Rad5-Rad18, Rad5-Ubc13, and Rad18-PCNA proteins. To gain insight into the significance of the above interactions, we characterized the enzymatic activities of the above complexes, and examined whether these proteins can be subject for Rad18-dependent ubiquitylation. We have managed to monoubiquitylate PCNA by Rad6-Rad18 enzyme in vitro and after purifying Ub-PCNA, we characterized its stimulatory effect on translesion synthesis polymerases. Based on these results, we have initiated a new study, as well, aiming to characterize the human homologue of yeast Rad5 protein and to unravel the function of PCNA ubiquitylation in damage bypass in human cells