Fehérje-kölcsönhatások szerkezeti alapjainak feltárása és a kölcsönhatás szelektív gátlása irányított evolúciós eljárásokkal = Deciphering the structural basis of protein-protein interactions and their selective inhibition via directed evolutionary methods

Abstract

Fő célom az volt, hogy meghonosítsam az irányított fehérjeevolúció szemléletét, és legsikeresebb technológiáját, a fágbemutatást. Egyrészt azt kutattuk, mi szabja meg a proteáz inhibitorok affinitását és specifitását. Három inhibitort vizsgáltunk: a kispeptid SFTI-t (Sunflower Trypsin Inhibitor), a kis fehérje SGPI-t (Schistocerca Gregaria Protease Inhibitor) és a homodimer Ecotint (E. Coli Trypsin Inhibitor). Másrészt inhibitorokat fejlesztettünk olyan humán proteázok ellen, amelyeknek nem volt ismert szelektív gátlószere. Mindhárom inhibitort sikerült evolválnunk. Feltártuk, hogy az SFTI mely csoportjai fontosak a molekula stabilitása és a proteázzal létesített specifikus kölcsönhatás szempontjából. Az SGPI családban feltártuk, hogy a hidrofób mag összetétele kihat a felszíni csoportokra és így a proteázzal alkotott komplex stabilitására. Egy rekord-felbontású SGPI variáns-tripszin komplex szerkezet által finomítottuk a szerin proteázok működési modelljét. Az Ecotint egyláncú formában fejeztük ki fágon, így a két monomer rész külön-külön evolválható lett. Szelektív inhibitorokat fejlesztettünk a hasnyálmirigy enzimek fő szabályzó proteáza, a kimotripszin C ellen, és a komplement rendszer lektin útjának MASP-1 és MASP-2 proteázai ellen. A MASP-gátlókkal létrehoztuk az első lektin út szelektív inhibitorokat, és korrigáltuk az útvonal-aktiválódás korábban hibásan leírt mechanizmusát. A projekt során 11 cikk, 3 szabadalom, 3 PhD dolgozat és tucatnyi tudományos díj született. | A major project goal was to establish in Hungary the principle and technology of directed protein evolution. Via phage display I aimed to decipher fundamental rules governing affinity and specificity of protease inhibitors focusing on 3 inhibitors: the small peptide SFTI (Sunflower Trypsin Inhibitor), the small protein SGPI (Schistocerca Gregaria Trypsin Inhibitor) and the homodimer Ecotin (E. Coli Trypsin Inhibitor). I also aimed to evolve selective inhibitors against human proteases lacking such blockers. We identified SFTI residues providing inhibitor stability and those involved in specific protease-binding. In the SGPI family we revealed that the hydrophobic inhibitor core greatly affects the function of surface residues and thereby the stability of the protease-inhibitor complex. Based on an ultrahigh resolution SGPI variant – trypsin structure we refined the model of serine protease catalysis. We displayed Ecotin on phage in a single-chain format such that the two monomers could be evolved independently. We developed selective inhibitors against a major regulatory pancreatic protease, human chymotrypsin C. We also evolved mono-specific inhibitors against the lectin pathway complement proteases MASP-1 and MASP-2. With these we developed the first lectin pathway selective complement inhibitors and corrected the hitherto incorrect pathway activation model. Altogether 11 papers, 3 patents, 3 PhD thesis and a dozen scientific awards indicate the success of the project