Tripartite multidrug efflux pumps in the human pathogen Salmonella typhimurium

Abstract

Der intrazelluläre Krankheitserreger Salmonella infiziert sowohl menschliche als auch tierische Wirte und ist eine häufige Ursache von Lebensmittelinfektionen. Abhängig von der Subspezies kann er entweder eine Magen-Darm-Infektion oder eine systemische Erkrankung verursachen. Während in leichten Fällen meist keine besondere Behandlung notwendig ist, werden schwerere Formen der Krankheit mit Antibiotika behandelt. Dabei ist die Evolution von multiresistenten Stämmen ein wiederkehrendes klinisches Problem bei Salmonella wie auch bei anderen Gram-negativen Bakterien, etwa E. coli oder Pseudomonas aeruginosa. Die Multiresistenz betrifft nicht nur Antibiotika, sondern auch andere toxische Substanzen wie Detergentien und Desinfektionslösungen und ist oft verbunden mit einer erhöhten Fähigkeit der Bakterien, diese Substanzen mit Hilfe von aktiven Membrantransportern zu exportieren. Diese sogenannten „multidrug efflux pumps“ reichen in Gram-negativen Bakterien oft durch beide Membranen und bestehen aus drei Komponenten in unterschiedlicher Kopienzahl: i) einem Transporter in der inneren Membran, der die Energie für den Substrattransport liefert, ii) einem Kanal in der äußeren Membran, und iii) einem periplasmatischen Adaptorprotein, welches als verbindendes Element zwischen den beiden dient. Basierend auf ihrer Funktionsweise werden diese Effluxpumpen eingeteilt in primäre Pumpen, die ATP als primäre Energiequelle verwenden, und sekundäre Pumpen, die als Ionen/Substrat Antiporter wirken und die elektrochemische Potentialdifferenz an der inneren Membran ausnutzen. Die vorliegende Studie untersucht je ein Mitglied beider Klassen: Ausgewählt wurden MacAB-TolC als der wichtigste Repräsentant der tripartiten Pumpen vom ABC-Typ sowie der Proton/Substrat Antiporter AcrAB-TolC, der die klinisch relevanteste und am besten untersuchte tripartite Effluxpumpe ist. Die detaillierte Struktur und der Assemblierungsmodus des MacAB-TolC Komplexes ist großteils unbekannt, während zur AcrAB-TolC Pumpe bereits einige strukturelle Studien durchgeführt wurden – allerdings keine davon mit dem nativen Proteinkomplex. Während meiner experimentellen Arbeit konnte ich beide Effluxpumpen direkt im Ursprungsorganismus (S. enterica serovar Typhimurium) überexprimieren, wodurch die Assemblierung unter nativen Bedingungen erfolgen kann. Ein etabliertes Protokoll ermöglichte die Isolierung aus Membranfraktionen und die Visualisierung von beinahe-nativen Effluxpumpen in „negative-stain“ Elektronenmikroskopie sowie im Falle von AcrAB-TolC auch in der Kryo-Elektronenmikroskopie. Für die individuelle Expression der zwei Pumpen wurde ein Deletionsstamm generiert, in dem keine anderen wichtigen tripartiten Effluxpumpen stark exprimiert werden, die die verlässliche Identifikation und Zuordnung der sichtbaren Partikel stören könnten. Weiters wurde die periplasmatische Komponente von MacAB-TolC aufgereinigt und für die Produktion polyklonaler Antikörper verwendet, und die Funktionalität der Plasmid-exprimierten Pumpen wurde bestätigt. Wir hoffen, dass unsere Bemühungen zu einem besseren strukturellen und mechanistischem Verständnis der tripartiten Effluxpumpen führen und zur Entwicklung neuer Strategien zur Bekämpfung multiresistenter Keime beitragen könnenThe intracellular pathogen Salmonella infects both human and animal hosts and is a common cause of foodborne diseases, causing gastrointestinal illness or systemic infection depending on the serovar. While for light cases treatment is usually not necessary, patients with more severe forms of disease depend on antibiotic treatment. However, evolution of multidrug resistant strains is a recurring clinical problem for Salmonella as well as for other Gram-negative bacteria such as E. coli and Pseudomonas aeruginosa. This multidrug resistance includes not only antibiotics but also other toxic substances such as dyes, detergents and disinfectants and is often associated with increased ability of the bacterial cell to expel these substances via active membrane transporters. These multidrug efflux pumps in Gram-negative bacteria often span both membranes and are built up of three components in different copy numbers: i) an inner membrane transporter which provides the energy for substrate transport, ii) an outer membrane channel and iii) a periplasmic adaptor protein that acts as a connecting element between the two. Based on their mode of action, these tripartite efflux pumps are classified into primary-type pumps that use ATP as their primary energy source and secondary-type pumps which work as ion/drug antiporters and exploit the electrochemical potential gradient at the inner membrane. In this study, I investigated one member of each group: MacAB-TolC was chosen for its role as the major representative of the ABC-type tripartite pumps, while the proton/drug antiporter AcrAB-TolC was chosen as the most clinically relevant and best characterized of the tripartite efflux pumps. The detailed structure and assembly mode of the MacAB-TolC complex is largely unknown, while for AcrAB-TolC, some structural studies have been made, though none of them of the native protein. During my experimental work I managed to overexpress both efflux pumps directly in the organism they stem from (S. enterica serovar Typhimurium), therefore allowing assembly in native conditions. An established protocol allowed the isolation from membrane fractions and visualization of the near-native efflux pumps in negative-stain electron microscopy and for AcrAB-TolC also in cryo-EM. For individual expression of the two pumps, a mutant strain was constructed where presumably no other major tripartite efflux pumps are highly expressed, ensuring a more reliable identification and assignment of visualized pump-shaped particles. Furthermore, the periplasmic component of MacAB-TolC was purified and used for production of polyclonal antibodies, and the functionality of plasmid-expressed pump operons was assessed. Ultimately, we hope that our efforts will lead to a better structural and mechanistic understanding of these tripartite efflux pumps and contribute to the development of new strategies to fight multidrug resistance