Antivirális és rákellenes hatóanyagok sejtbejutásáért felelős humán hCNT1 nukleozid transzporter szubsztrátkötő centrumának meghatározása új kísérleti rendszer kifejlesztésével = Determination of substrate binding centre of human nucleoside transporter hCNT1 implicated in the transport of antiviral/anticancer drugs through novel experimental approaches

Abstract

1. Mutáns génbankokat hoztunk létre a humán hCNT1 cDNS-ből, valamint a 2. pontban létrehozott funkcióvesztéses mutáns E497Q-hCNT1 cDNS-ből (technikai kontroll), és funkciónyeréses mutánsok izolálásához elkezdtük a transzformációs kísérleteket. 2. Létrehoztuk az E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutánst a hCNT1 cDNS molekula irányított pontmutációjával a mutáns génbank létrehozásának technikai ellenőrzése céljából. 3. Létrehoztuk az Aspergillus nidulans cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 deléciós recipiens törzset a cntA::riboB pyrG89 pyroA4 biA1 riboB2 és pantoB100 riboB2 törzsek keresztezésével. A recipiens törzs a humán hCNT1 heterológ expressziós rendszerben történő funkcionális kifejeződésének ellenőrzését szolgálja, valamint az E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutáns molekulából létrehozott mutáns génbank transzformációját szolgálja. 4. Létrehoztunk egy új, autonóm replikatív Aspergillus expressziós vektort. A 13,2 kb méretű pNNPanto vektort a pAnGFP integrálódó GFP fúziós kiindulási expressziós vektorból hoztuk létre 4 módosítást követően. 5. A hCNT1 és a 2. pontban leírt E497Q-hCNT1 funkcióvesztéses mutáns hCNT1 cDNS heterológ expressziós rendszerben történő kifejeztetésével igazoltuk, hogy a hCNT1 aktív uridin transzportert fejez ki A. nidulansban, valamint ellenőriztük, hogy a mutáns E497Q-hCNT1 nem képes uridin szállításra. 6. Létrehoztunk különböző „uptake” deficiens recipiens törzseket a mutáns génbankok transzformálására és a funkciónyeréses mutánsok screeneléséhez. | 1. Mutant gene banks from human hCNT1 cDNA and hCNT1 cDNA derived non-functional E497Q-hCNT1 molecule (for technical control purpose) were constructed and used for screening of gain-of-function mutants. 2. A non-functional E497Q-hCNT1 mutant hCNT1 cDNA molecule was constructed by directed point mutagenesis for the purpose of generation and using the E497Q-hCNT1 mutant gene bank to evaluate technically the process of mutant gene bank generation. 3. cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 A. nidulans deletion mutant was developed by crossing cntA::riboB pyrG89 pyroA4 biA1 riboB2 with pantoB100 riboB2 for the purpose of test-transformation of (i) hCNT1 and E497Q-hCNT1 in the heterologue expression system; (ii) transformation with E497Q-hCNT1 mutant gene bank. 4. Novel autonomous expression vector of A. nidulans, pNNPanto was developed by engineering the existing pAnGFP integrative GFP fusion A. nidulans vector in four steps. 5. Heterologous expression of the human hCNT1 and E497Q-hCNT1 and the expression of A. nidulans CntA (AN5493.3) cDNAs cloned in pNNPanto autonomous expression vector were carried out in cntA::riboB pyrG89 pantoB100 riboB2 recipient strain. 6. Hypoxanthine/uric acid uptake deficient mutant uapA24 uapC201/401 azgA4 pantoB100 was developed by cross of uapA24 uapC201/401 azgA4 pabaA1 strain with pantoB100 riboB2 mutant for the purpose of direct screening for gain-of-function mutants