Screening, cloning and expression analysis of immune-relevant genes in Chinese soft-shelled turtle Trionyx sinensis

Abstract

摘 要 本研究在最为薄弱的爬行动物免疫学研究领域进行了有意义的探索。应用抑制性差减杂交技术，首次构建了一个与嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 感染有关的中华鳖 (Trionyx sinensis) 主要内脏器官的差减cDNA文库。从200多个克隆中筛选到42个差异或上调表达的基因，其中16个与免疫相关基因系爬行类首次鉴定。经虚拟Northern 杂交和RT-PCR验证，其中的6个基因（IL-8、SAA、CD9、ATF4、CL和毒素样蛋白）在中华鳖感染组织均上调表达。 通过RACE方法得到中华鳖IL-8、SAA、毒素样蛋白、CD9和Fg基因的全长cDNA序列并进行了分子结构和进化分析；通过Genome Walking方法得到前3个基因的基因组及启动子序列。中华鳖IL-8基因组全长4924 bp，由三个内含子和四个外显子组成；cDNA全长为1188 bp，开放阅读框包含312 bp，编码蛋白为104个氨基酸，含有保守的CXC结构域、4个半胱氨酸和与功能相关的ELR基序。SAA基因组全长3153 bp，由两个内含子和三个外显子组成；cDNA全长为554 bp，开放阅读框包含381 bp，编码蛋白为127个氨基酸，C-端氨基酸十分保守，N-端由疏水氨基酸组成。毒素样蛋白基因组全长1995 bp，由两个内含子和三个外显子组成；cDNA全长为580 bp，开放阅读框包含267bp，编码蛋白为89个氨基酸，含有8个保守的半胱氨酸和三指蛋白家族的标志序列C-末端CCXXXCN基序。CD9 cDNA全长为1146 bp，开放阅读框包含672bp，编码蛋白为224个氨基酸，包含四个跨膜结构域（TM）和大小两个胞外环（LEL和SEL），LEL内含有保守的CCG基序和4个半胱氨酸，SEL内含一个N-端糖基化位点。Fg cDNA全长为1605 bp，开放阅读框包含1320bp，编码蛋白为440个氨基酸，含有FReD结构域、N-末端球形结构域C-gamma、Ca2+结合位点和聚合口袋结构等。系统进化分析显示，除毒素样蛋白与一种美洲大毒蛇的毒素样蛋白聚为一支外，其余四个蛋白均与鸟类的同源分子聚为一支。 RT-PCR分析显示在中华鳖相关组织中均检测到IL-8、CD9和毒素样蛋白基因的转录产物。其中IL-8基因为组成型表达；CD9基因主要在肝和脾组织表达；而毒素样蛋白基因主要在肝和肾组织中表达。RT-PCR结果表明，除SAA外，其余4种急性期蛋白（APP）Fg、C3、ALB和 CL基因均在肝组织表达。 通过RQ-PCR，发现在嗜水气单胞菌感染条件下，IL-8、CD9和毒素样蛋白在中华鳖相关组织中呈现动态表达变化。其中IL-8基因于感染后第4天以肝、脾和肾组织上调表达最明显；而CD9基因在2-4天以肝、脾和血液上调表达最明显；毒素样蛋白基因于感染后第1–2天以肝、脾、心脏和血液上调表达最明显；除ALB基因下调表达外，其它4种APP基因在肝组织均有不同程度的诱导表达，其中SAA于感染后第2天在肝组织上调至2000倍；表明这些基因的表达变化与爬行类抗细菌免疫密切相关。 完成了中华鳖IL-8基因的原核表达和蛋白纯化。趋化实验表明，rIL-8蛋白浓度为1.0―20ng/ml时对中华鳖嗜中性粒细胞有趋化作用，对淋巴细胞趋化作用不明显。首次证实了爬行动物rIL-8对嗜中性粒细胞的趋化作用