Identification and Characterization of Two Genes Related to Eye Development in Goldfish (Carassius auratus)

Abstract

金鱼有多种品系，且所有品系均起源于中国的野生鲫鱼(Carassius auratus)。就金鱼眼睛的变化而言，有正常眼、龙睛、望天眼、水泡眼等许多种，所以它是研究眼睛发育的好材料。为了探讨这些突变体形成的分子机理，我们首先以正常眼的草金鱼作对照，以龙睛为材料开展了研究。 对正常眼和龙睛的内部结构比较分析表明，成熟的龙睛比对照正常眼体积大；瞳孔小；晶状体结构疏松；视网膜薄，正常眼视网膜外核层有8层细胞核，内核层有5层细胞核，靠近色素细胞层的细胞核为长椭圆形，而龙睛视网膜外核层和内核层挨在一起，共有5层细胞核，几乎辨认不出外网织层，所有的细胞核近圆形；角膜比正常眼少了本处发生层。与正常眼相比，龙睛色素上皮层的突触和视锥、视杆细胞的外段呈无序的形式排列。正常眼和龙睛的早期的形态发生过程基本相同，与其它硬骨鱼类相比也没有明显的差别。至出苗1到2个月，龙睛的性状才能用肉眼观察出来，眼球开始膨大，并逐渐突出于眼眶外，视网膜和脉络膜也变得很薄，直至成熟的龙睛眼睛形成。基于以上这些形态观察，我们对Six3基因在龙睛和正常眼中的定位和Prox1基因在正常眼中的定位进行了分析。 脊椎动物的six家族转录因子与果蝇的sine oculis基因同源，sine oculis基因在果蝇眼睛发育中起重要作用。我们克隆了正常眼金鱼和龙睛眼金鱼的Six3 cDNAs，推测的氨基酸序列完全相同，且与斑马鱼Six3b的同源性高达 97.3%。在早期的胚胎发育阶段，Six3 蛋白在正常眼和龙睛中的表达模式相似，没有明显的差别。但在出苗2天后，Six3蛋白在龙睛视网膜外核层细胞质中的表达量开始比草金鱼大。这一特点一直持续到龙睛的性状表现出来。这个时期正好处于眼睛发育的生长期之前和之初。此后，龙睛的眼球进一步增大，其视网膜外核层的一些细胞的细胞核中也可以检测到Six3蛋白的明显信号，且这样的细胞占细胞总数的比例有增加的趋势。而在成熟龙睛的视网膜中，Six3蛋白在外核层和内核层一些细胞的细胞核中检测到的信号也比正常眼强。 脊椎动物的Prox1基因，与果蝇的转录因子prospero同源。该基因对多种器官的发育有重要的调控作用。整体原位杂交的结果显示，金鱼Prox1 mRNA首先是在晶体期的晶体原基中有显著的转录。心跳期，在整个未成熟的晶体中和视网膜的幼芽区可以检测到Prox1 mRNA。晶体纤维形成后，它主要定位于视纤维层和内网织细胞层。免疫组化的结果显示，心跳期Prox1蛋白的定位与mRNA相同，晶体纤维形成以后，Prox1蛋白主要定位在晶体上皮细胞内侧的晶体纤维上一个环状区域。在成熟的草金鱼晶体纤维和晶体上皮中仍可以检测到Prox1蛋白的表达。Prox1 基因在晶体发生过程中有一个定位迁移的过程，这个过程与小鼠Prox1 基因由晶体外到晶体内的迁移过程相反