Expression and Functional Analysis of piwi and vasa in Medaka

Abstract

在大多数动物里，早期的胚胎发育产生两大类细胞：体系细胞和种系细胞。种系细胞源于原始生殖细胞（PGC），PGC是从早期胚胎的体细胞中分化而来的，经过长距离的跋涉迁移到生殖腺，然后形成精子和卵子，精卵结合产生新的个体，从而保证物种的延续和进化。因此了解生殖细胞的形成、发育及其命运维持的分子机制对操作生殖细胞极为关键。作为生殖细胞的标记基因，piwi和vasa的表达模式和功能分析在物种间广为研究。本文旨在以青鳉为模式生物，研究piwi和vasa的表达模式及其在鱼类生殖细胞形成与发育过程中的作用。 Piwi基因最早是从果蝇卵巢中分离出来的，对生殖干细胞的增殖和分裂有调控作用,其功能在进化上具有保守性。目前青鳉piwi的研究还没有报道，本研究克隆到的青鳉piwi基因(opiwi)cDNA全长为2.9kb，编码857个氨基酸，在N端和C端分别具有保守的PAZ结构域和PIWI结构域。系统树显示opiwi属于piwi亚族，和斑马鱼的piwi相似性最高。Opiwi和人的piwi基因具有相似的基因结构和染色体分布。Opiwi RNA是母源性的，在整个胚胎发育过程都有表达。在早期的胚胎发育过程中，opiwi RNA和蛋白均匀分布在每个卵裂球；在体节期，opiwi除了在PGC大量表达外，我们还发现其在眼睛、脑以及尾部等体细胞也有微弱表达。oPiwi蛋白以颗粒状分布在PGC的核周。在成体组织里，opiwi RNA和蛋白虽然在性腺大量表达，在眼和脑神经系统也有表达。在性腺里，opiwi RNA和蛋白仅在生殖细胞里有表达，而在其他体细胞则没有表达。在卵子发生过程中，opiwi在卵原细胞和早期的卵母细胞大量表达，随着卵子发育，其表达逐渐下降，在成熟的卵母细胞里，其信号呈点状或薄层分布；在卵母细胞里，opiwi和线粒体共定位于卵子的生殖质结构巴尔氏小体（Balbiani body）；我们还发现在卵原细胞里，oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在其核周；此外oPiwi蛋白除了在细胞质有分布外，在细胞核也有分布，其细胞核定位和PCNA(proliferating cell nuclear antigen)及线粒体相同。在精子发生过程中，opiwi RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达，opiwi的RNA在精子细胞和精子里没有信号，而其蛋白在精子细胞和精子里持续表达，且和线粒体共定位于生精细胞的生殖质结构拟染色体（chromatoid body）；oPiwi蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布，而在其他生精细胞则只在细胞质有分布。oPiwi还以中空的颗粒结构分布在精原细胞的核周。在干细胞系中，opiwi RNA和蛋白都有大量表达，其蛋白在细胞质和细胞核均有分布。此外,我们还发现opiwi 3’非编码区（3’untranslated region, 3’UTR）在囊胚晚期(9hpf)就能特异性地标记PGC，而目前报道最早能区分青鳉PGC的nanos3’UTR则是在原肠早期（13hpf）。我们通过减少或增加opiwi的表达来研究其功能，PGC用nanos启动子驱动的绿色荧光和vasa启动子驱动的绿色荧光双标记（NgVg），这样我们可以从原肠中期就可以追踪PGC的发育。结果表明注射opiwi的Morpholino(MOpw)消减opiwi的表达对PGC发育和早期胚胎发育以及体细胞发育具有双重作用：MOpw导致PGC数目减少以及异位PGC，同时早期的胚胎发育和晚期胚胎发育的体细胞的发育也受影响；体外细胞培养表明，注射MOpw导致PGC和体细胞的分裂受阻。而MOpw和opiwi的RNA共注射能挽救MOpw的表型。进一步的实验表明是母源性的opiwi影响生殖细胞的发育和早期的胚胎发育，而合子性的表达仅影响晚期胚胎的体细胞发育。过量表达正常或缺失去掉PAZ结构域的RNA也影响生殖细胞发育和胚胎发育。因此，opiwi除了影响青鳉的生殖细胞的形成发育这一高度保守的功能外，我们还发现其在体细胞的发育也起着重要作用。 Vasa是进化上功能保守的翻译调控因子。它最初从果蝇中分离出来，对前后轴的极化和生殖细胞的形成是必需的。vasa同时在其他物种的生殖细胞的发育也起着重要作用，但它在早期的胚胎发育和生殖细胞的发育中的具体功能还不清楚。迄今，青鳉的vasa RNA仅见于生殖细胞，vasa启动子的活性亦是生殖细胞特异的，其蛋白的表达尚无详细的报道。本研究表明vasa RNA和蛋白的表达模式和opiwi基本一致，即是母源性的，在胚胎发育的原肠前期表达很强，随后开始降低。在早期的胚胎发育过程中，vasa均匀分布在每个卵裂球；在器官发生期，vasa除了在PGC大量表达，此外还在体细胞如脑、躯干和尾部也有表达。Vasa蛋白和oPiwi蛋白以中空的颗粒分布在PGC以及性原细胞的核周。在成体组织中，vasa RNA除在性腺大量表达外，在体细胞也有微弱表达。Vasa RNA和蛋白仅在性腺的生殖细胞有表达。在卵子发生，vasa RNA和蛋白在整个卵子发生都有表达，且和oPiwi共定位于巴尔氏小体。Vasa蛋白在卵母细胞的细胞质和细胞核都有分布。在精子发生阶段，vasa RNA和蛋白在精原细胞和精母细胞大量表达，vasa RNA在精子细胞和精子里没有信号，而其蛋白在精子细胞和精子也有微弱表达。Vasa蛋白在精原细胞的细胞质和细胞核都有分布，而在其它生精细胞仅在细胞质有表达。在精子细胞和精子阶段，Vasa和oPiwi共定位于拟染色小体。与其表达模式相对应的是，vasa在青鳉鱼PGC的发育和体细胞的发育过程中具有双重作用。注射MO消减vasa的翻译表达，PGC不能迁移到目的地--生殖腺。单个细胞的体内体外实验表明消减vasa的表达不改变PGC的动性，存活能力和分裂。即使在性腺外的异位PGC也具有动性，能够存活和分裂。将注射MOvas的胚胎的细胞在中囊胚时期移植到同样时期的野生型胚胎，PGC不能迁移到生殖腺。并且，注射MOvas，还会导致早期发育阶段胚胎大量死亡，活着的胚胎也伴随大量体系细胞的死亡；将注射MOvas后的胚胎的细胞在原肠早期分离出来，在体外培养第四天，也观察到大量的体细胞死亡。因此，我们推测vasa在青鳉的胚胎发育过程中具有双重作用：在生殖细胞的发育过程中，它对生殖细胞的迁移是必要的、自主性的；在体系细胞中，它在原肠期胚胎分层和体细胞的维持方面起着重要作用。我们还证实了生殖腺外异位的PGC和体外培养的PGC有维持着它自身特性的能力，即PGC的特性是自主性的。 综上所述，opiwi和vasa主要在青鳉的生殖细胞里表达并起作用，同时我们也证实这2个基因在体细胞发育具有新功能。 关键词：生殖细胞，opiwi,vasa，精子发生，拟染色小体，卵子发生，巴尔氏小体，青