陈加平,徐立红,张甬元

Institute of Hydrobiology, Chinese Academy Of Sciences

5 3 7 
第 22卷 第 1期 
I 9 9 8年 3 月 
水 生 生 物 学 报 
ACTA HYDROBlOLOGICA SINICA 
Vol 22 No 】 
Maf 】9 9 8 
j研究简报 
微囊藻毒素对鱼组织匀浆液蛋白磷酸酶 
活性抑制作用的研究 
陈加平 徐立红 张甬元 
『中国科学院水生生物研究所．武汉 430072 
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A SrUDY oF IN}{lBITIoN oF ⅣⅡCRoCY INS oN PRoTEIN 
PHos]PHATASE IN FISH TISSUE HoM oGENATE 
Chen Jiaping，Xu Lihong and Zhang Yongyuan 
(Institute of drobiolo~<v．Ihe Chinese Ac'adem~ S~ieel(e~',t~than 430072) 
关键词 蛋白磷酸酶，组织匀浆液．微囊藻毒素，抑制 
Key words Protein phosphat~se，Tissue homogenate，M icrocy stins，Inhibition 
蛋白磷酸酶是在调节细胞内蛋白磷酸化水平方面具有重要作用的酶。研究表明，蛋白磷酸化水 与 
肿瘤 的促进 作用密 切相 关，激话蛋 白激 酶 C和抑 制丝氨 酸 ，苏氨 酸蛋 白磷 酸酶 (Ser，Tlar Protein 
phospitatase，简称 PP，根据对抑制剂的敏感性和对二价阳离子的依较性 ，分为 l，2A，2B，2c四类，的物质 
都对肿瘤形成起促进作用 近期研究发现，天然有毒物微囊藻毒素对 PP1和 PP2A活 眭具有极强的抑制 
作用⋯ 对 PPI和 pP2A具有极强抑制作用的这一物质的发现有重要意义，从酶学研究来看，由于这类物 
质对酶抑制作用专一和灵敏 因而可作为理想的分子探针用于对生物体内各类 PP的研究；从生态毒理学 
考虑，由于 PP抑制程度可反映一类具有相 同作用机理物质的总量，因而可用来定量检测环境中促肿瘤物 
的量以及用来评价化学品的潜在促肿瘤作用．当考虑蛋白磷酸酶作为分 子生态毒理学指标而用于环境 
监测时，方法的简化是 十分重要的。由于蛋 白磷酸酶的纯化步骤较为繁琐 ，给化学品的活体敷毒测定工 
作带来不便，而组织匀浆液 比较容易得到，利于括体致毒测定工作的大量进行，因此，验证用纯化的酶进 
行实验的条件是否 同样适合于匀浆液．研究微囊藻毒素对组织匀浆液中蛋 白磷酸酶的抑制作用 的特点， 
并与对纯化的酶的抑制作用模式及其程度进行比较显得非常必要。 
1 材料与方法 
1．1 蛋白磷酸酶的分离纯化 取草鱼肝脏，按照文献 [21中的方法，得到的 PP2A分装后，贮存于 一2o℃， 
1．2 组织匀浆液的制备 取草鱼肝脏、肾脏，分别加适量 (w ，V= I，10)含 0 25mol，L蔗糖的缓冲溶 
液 A(50ramol，L Tris，pH7 4，含 2retool，L ED'fA、2mmol／L EGTA、0．2mmo]，L PMSF,2retool，L巯 
基乙醇和 10％甘油)．置冰浴中，匀浆，经离心 (6000g，4℃，30min)．所得 上清液分装．贮存于 一20℃． 
国家 自然科学基金资助．编号39400024 淡水生态与生物拄术国家重电实验室资助 
1997-03 I2收 到 
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水 生 生 物 学 报 22卷 
I．3 底物制备 参照文献 [21进行。 
1．4 酶活力测定 参照文献 [2]进行， 
1+5 抑制作用比较 参照文献 【2]进行 用毒索存存时酶的丰}i对活力 与毒索浓度的对数作同 
1．6 试剂 微囊藻毒素 LR、YR RR，日丰名城大学原 田健一教授赠送 
2 结果与讨论 
2．I 组织匀浆液反应条件的确定 
组织匀浆液相对活力以反应产生的v Pi占加人的底物的总Y ”P计数的百分 比来表不 在肝．肾匀 
浆液稀释倍数分别为 32．16，8，4，2时，测定它们对糖原磷酸化酶 a脱磷酸化的活力(图 1) 从用 1看 
IP,．当稀释倍数为 32，即肾匀浆液蛋白量 0—2 0 g．肝 匀浆液蛋白量 0—2I5 g时，酶蛋白量 与活力呈线 眭 
关系 将肝、肾匀装液均稀释 32倍，分别进行反应时间一话力实驻 (罔 2) 从圈 2叮看出，在 12rain 内， 
相对活力与反应时 日^J呈线性 关系，因此，10rain的反应时间对肝、肾匀浆液的括性实验来说是合适的。 
2．2 微囊藻毒素对组织匀浆液蛋白磷酸酶活性的抑制 
酶抑制实验中用不加抑制剂时的酶括力作为 100％，测定不 同抑制剂浓度 时的酶的相对活力。用促 
忡瘤剂微囊藻毒素 LR YR、RR分别对肝 肾匀浆液进行抑制实验，从图 3可“看出，微囊藻毒素对肝、肾 
匀浆液中蛋白磷酸酶话性抑制作用的模式 与对纯化的 PP2A的一样．反应曲线呈典型的 S彤。就对酶活 
稀 释倍 数 Dilution faclo r 
罔 l 相 对活力 与蛋 白浓度 的关 系 
Ftg 1 RelationshiP between reladve activity, 
and protein concentrauon 
● 肾匀浆液 Kidney homogenam 
4 8 12 1 6 
反 应时 间 train)Reaction time 
图 2 辊对活力与反应时间的关系 
Fig 2 Relationship between ~lafve 
ac vl and ~acfion time 
▲ 肝匀浆涟 Liver homogena~ 
性的影响而 言，LR最大，YR次之，RR最小，这与毒性实验的结果是一致的 
2．3 抑制作用的比较 
比较 LR．Y R'RR对肝匀浆液与肝 PP2A抑制的结果 【图4)，可以看到．尽管匀浆液成分复杂，但三种 
表 1 I_R YR、RR对三种酶和制剂的半抑制浓度fnmol，L】 
Tab 1 IC
， ll 
of LR YR, RR tO protein phosphatase 
LR YR RR 
匀浆 液 Kidney homogenam 0 32 0 38 0．8l 
月f匀浆 液 l iver homogenate 0 30 0 32 0．70 
肝 PP2A Liver PP2A 0 25 0 39 0．62 
毒素对其蛋白磷酸酶活性抑制作用的模式和程度与对纯化的 PP2A的作用是完全一致的。对三组 曲线的 
数据用灰色系统理 奁进行关联度检验，在 P为 0 5时，LR,YR,RR对两种酶制备物的抑制作 用曲线的关 
联度分别为 0 65，0 69，O．70，结果表明曲线间的丰甘似程度是可信赖的Ⅲ．由此可以证明．微囊藻毒素对蛋 
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期 陈加平等：微囊藻毒素对鱼组织匀浆液蛋白磷酸酶活性抑制作用的研究 97 
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A 
毒豪 酿 度 Mirfc y doneen ra a(mno L／L 
图 3 微囊藻毒素对几种酶制备物的抑制作片j。 
Fng 3 Inhibition 0r micmcystins Ott enzyme preparations 
(A：肾匀浆液 Kadney homogena~，B：肝匀浆藏 Liver homogenate) 
● LR A YR 甲 RR 
A B C 
狼度 c⋯ eⅡtrat 口n(nmol／L 
巨 4 徽囊藻毒索对肝匀浆液和肝 PP2A抑制作用的比较。 【A：LR．B YR，C：RR) 
Fig．4 Comparison between inhibition of microcystitls On liver homogenate and PP2A 
● 肝匀装液 LiveT]~omogenate A 肝 PP2A Liver PP2A 
白磷酸酶 I和 2A的作用是专一性的，不受系统中存在的其它磷酸酶和蛋 白的影响。 
由图 3、圈 4汁算出 LR、YR、RR对肾、肝匀浆液和肝 PP2A的半抑制浓度 IC 口表 I 毒素对几种酶 
的 1C 十分接近，与文献 【2，5】报道的结果是一致的一 
本研究结果为用组织匀浆液代替纯化 的酶进行抑 制实验及化学品的括体致毒测定提供了依据，而 
且，在用放射性同位 素标记法进行促肿瘤作用研究时，用组织匀浆液作为酶制备物将更为方便。 
参 考 文 献 
l】 棘立红，张甬兀．微囊藻毒索分干致毒机理研究近况 水生生物学报-】993．17(4)：365—374 
2 1 豫立红等．鱼肝中蛋 白磷酸酶的分离纯化．求生生物学报．1995，19【4)：379—381 
3】 Harada．K-I Chemistry and detection of microcystms In：Toxic microcystin,s，Ed M F Walanabe．I996， 
n】03一 l48 CRC press 
4 1 邓聚龙 灰色 预删与决策．华中理工大学 版牡．1986 
5】 Alistair T R et al Pmlein Phosphatase activity in cymmbacteriM consequences for microcysfi gt toxicity 
,analysis To2a'con，l 993，3I[9)l1 79— 1I 86 
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微囊藻毒素对鱼组织匀浆液蛋白磷酸酶活性抑制作用的研究

http://ir.ihb.ac.cn/bitstream/152342/4166/1/%e5%be%ae%e5%9b%8a%e8%97%bb%e6%af%92%e7%b4%a0%e5%af%b9%e9%b1%bc%e7%bb%84%e7%bb%87%e5%8c%80%e6%b5%86%e6%b6%b2%e8%9b%8b%e7%99%bd%e7%a3%b7%e9%85%b8%e9%85%b6%e6%b4%bb%e6%80%a7%e6%8a%91%e5%88%b6%e4%bd%9c%e7%94%a8%e7%9a%84%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf

微囊藻毒素对鱼组织匀浆液蛋白磷酸酶活性抑制作用的研究

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