从保存３个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡。液泡为标准圆球状，完全透明，大小相差极为悬殊，多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解，渗透冲击，低渗酶解和渗透冲击相结合，从培养３个月以上，２个月，１个月，１８ｄ，１０ｄ及３ｄ的藻丝细胞都分离到液泡。液泡略大于细胞，泡内无吞噬物。培养３ｄ的藻丝有１５％的细胞分离到液泡。其他多种蓝藻也分离到同样的液泡

郭厚良,金传荫,浦秋文,宋文贞,周云珍,杨清平

Institute of Hydrobiology, Chinese Academy Of Sciences

(互)3如一弓 
第 23卷 第 4期 
1 9 9 9 年 12月 
水 生 生 物 学 报 
ACTA HYDROBIOIX)GICA SIN／CA 
Vol 23．No．4 
Dec． i 9 9 9 
鱼腥藻 PCC7120细胞液泡的初步研究 20．2 
郭厚良 金传荫 秋文 宋文贞 周云珍 杨清平 
‘武议大学生命科学学院，武慢 430~72] 
(中国科学院求生生物研究所，武汉 430072) 
摘要 从保存 3个月以上的老化培养物中直接检查到游离液泡 液泡为标准圆球状，完全透 
明，太小相差极为悬殊，多数大型液泡吞噬了数个衰老藻细胞。采用低渗酶解，渗透冲击，低渗 
酶解和渗透冲击相结台，从培养 3个月以上．2十月，1个月，18d，10d及 3d的藻丝细胞都分离 
副液泡 液泡略大于细胞，泡内无吞噬物，培养 3d的藻丝有 15％的细胞分离到液泡。其他多 
种蓝藻也分离到同拌的液泡 
关毽词龟腥基E避12Q，迦、僻磷酗解’盏淼．{日犯 
很早就知道，衰老的蓝藻细胞形成液泡⋯，并且认为，液泡形成表明蓝藻细胞频临死 
亡 】。亚显微结构研究也曾发现，蓝藻的老化细胞内存在液泡式结构0 】 但 由于未能从蓝 
藻细胞 内分离液泡以进行深入研究，使得蓝藻液泡的存在得不到普遍承认 以至有人还 
认为，蓝藻液泡可能只是一种人工假象 因此，当植铂 和真菌 液泡的研究兴起的时 
候，蓝藻液泡的研究却中断，后来的文献也不再把液泡作为蓝藻生物学研究的一个问题进 
行讨论m 91 近年来，在蓝藻原生质球研究 中“ ” 注意到，某些无机盐能诱导一些蓝藻细 
胞产生泡状结构” 经电镜检查，证明此种泡状结构由单位膜所包围，故确认为液泡l】 。 
为了深人开展这方面研究，进行了 细胞中分离此种液泡的研究，并取得完全成功。研究 
中发现，蓝藻液泡具有特异的耐低渗性质，由此推测，衰老的蓝藻细胞可能由细胞 自溶破 
裂而释放液泡。如果衰老的蓝藻细胞确实形成液泡，那么，就有可能在衰老的蓝藻培养物 
中直接检查到游离液泡 为此，在成功分离诱导液泡的基础上，作者对蓝藻衰老培养物进 
行了液泡检查，并发现了液泡。由此对蓝藻非衰老细胞也存在液泡的可能性作了进一步 
研究 
1 材料和方法 
1．1 藻种及培养 主要用鱼腥藻 7120(Anabaena sp．PCC 7120)，对其他多种蓝藻进行 
Td,量试验。采用 Alen培养基，液体静止培养，间或振荡，培养温度 28"C(±0．5"C)，光照 
强度 2000 Ix。全部材料引 自中国科学院水生生物研究所 
国家自然科学基金资助项 目C编号：39870083 
1999-02—18收到 L999-07-1 3修回 
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364 水 生 生 物 学 报 23卷 
1．2 衰老液泡检查 对培养和存放 3个月以上的培养物进行检查，采取了两种方法。一 
是直接取培养物在显微镜下检查，二是对液泡进行浓集之后再取样检查。即将培养物倒 
入 l0×lOOmm粗试管，自然沉降一夜，弃去下沉的藻体，取上层清液 2000r／min离心 5min 
沉淀悬浮物，再取离心管底部的沉淀物检查。 
13 非衰老细胞液泡分离 为了排除制备原生质球分离液泡时渗透稳定剂和高渗透压 
可能的诱导作用，采取不加渗透稳定剂的酶处理破壁和机械手段破壁以游离液泡的方法， 
分别有三种：(1)低渗酶解法：将溶菌酶溶人蒸馏水，剂量 0．1％(w／v)，用 以处理藻丝细 
胞。当被处理材料释放出蓝色物质时，表明细胞发生大量破裂，即取样检查。(2)渗透冲击 
法：将藻丝先置于 lmol／L MgC1，高渗溶液中，30min后再转入蒸馏水，在蒸馏水中静置 
3rain后取样在显微 镜下橙查。因 MgCI．无液泡诱 导作用“ ，而且处理 时间短。因此， 
lmol／L Mga 30min处理不会产生诱导液泡。 (3)低渗酶解一渗透冲击法：将藻丝先用 
溶菌酶的蒸馏水溶液在 28℃条件下处理 30rain，然后转人 lmol／L MgC1 溶液中 30min，再 
转入蒸馏水 3min后取样检查。 
2 结果和讨论 
细心地检查衰老培养物，的确可以找到游离的液泡，虽然数量比较少，但结果是完全 
肯定的。发现液泡的频度主要与藻丝和细胞解体程度相关。解体程度高，检查时可看到大 
量破细胞和碎细胞渣，就可以很容易地找到较多的液泡。解体程度低，碎细胞渣很少，找 
到液泡就 比较困难。所谓发现液泡的额度和细胞降解程度只是一种粗放的主观估计，不 
是一个准确计量 的数字，因为准确统计 比较困难。但只要能通过细胞渣确认有细胞破裂 
现象，就可以找到液泡。从培养物直接检查液泡困难时，经浓集处理，再橙查液泡就容易 
了。衰老培养物中 自然存在的游离液泡也为标准圆球状，完全透明。与所分离的诱导液泡 
一 样，自然存在的游离液泡大小相差悬殊。大的液泡可达到 12 m以上，小的只有 2．5¨m 
体积很大的液泡显然由多个液泡融合而来。与诱导分离的液泡不同的是，从衰老培养物 
分离的大液泡都吞噬了数个衰老藻细胞(图 1．a)。从图 1．a可以看出，有些藻细胞完全位于 
液泡之中，而有些藻细胞则位于液泡膜表面，一半在液泡内，而另一半尚在液泡膜之外，表 
现为吞噬的一种中间过程。在检查衰老培养物时还注意到，衰老的培养物 中长藻丝解体 
为片段，异形胞丢失，部分藻丝片段细胞液泡化 (图 1．b)。圉 1．b清楚地显示，片段化的藻 
丝细胞内出现泡状结构，这一泡状结构和无机盐诱导的细胞结构泡状化 完全一样，为液 
泡所在位置。由此推测，液泡化细胞进一步发展便是细胞 自溶破裂，液泡释放 由于耐低 
渗，游离的液泡能在培养基中长时间存在，继而发生液泡与液泡，液泡与衰老细胞之间频 
繁的接触，从而产生液泡的相互融合和液泡对藻细胞的吞噬作用。因此，衰老培养物中天 
然存在的液泡充分表现了蓝藻液泡的耐低渗，稳定性高，易融合，吞噬能力强这些特点。 
衰老培养物中游离液泡的发现使得过去关于衰老的蓝藻细胞形成液泡的看法得到验证。 
由于这些液泡来 自衰老细胞的 自溶破裂，因此，形成液泡表明细胞额临死亡的观点似乎也 
是正确的。但是，人们显然要提出一个问题：这些液泡究竟是什么时候形成的?我们对这 
一 问题 进行 了实验分析。 
采用低渗酶解法 ，很容易地从培养 3个多月和2个多月的材料分离到液泡。从这种分 
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4期 郭 厚良等：鱼腥藻Pcc712O细胞液泡的初步研究 365 
离试验可以确定，并没有发生液泡化的藻丝 
材料也可以分离出液泡，这种材料不算很衰 
老。但 对培养 1个月的材料采用低渗酶解 
法处理 ，当蓝色物质释放细胞绝大部分破裂 
时，检查不到液泡 将低渗酶处理进一步延 
长24hr后，液泡出现 (图 1．c)。进一步对培 
养不满一个月的材料作低渗酶解，无论怎样 
延长处理也得不到液泡。渗透冲击法得到 
的结果有所不同，当材料在 1tool／L MgCI 
高渗条件下 30min后转人蒸馏水，渗透压急 
剧下降引起许多细胞破裂。采用这种方法， 
从培养 18d、 lOd、6d的材料都能得到液 
泡。这样，两种方法的结果不一致 我们注 
意到，两种方法处理比较年轻的培养物各存 
在不同的缺点。低渗酶解法产生的破裂细 
胞还保持着细胞的原有形态，可能仍对液泡 
有束缚作用，使其中的液泡难以释放。渗透 
冲击法细胞破裂率 比较低，如培养 6d的材 
料只能引起 3％的细胞破裂，处理 6d以下的 
材料细胞破裂率更低 为了克服两种方法 
t l ， 
、 
一嗲 
圈 I 鱼腥藻 POC 7l20液泡的幢查和分离 
E】 Determination and isotation of vacuoles in 
the blue-green alga A~abaena sp PCC 7[20 
a 培养和保存 4个月零 [4d的培养物中的游离液袍． 
b-液泡化的衰老藻丝，c 低渗酶解击处理培养 1个 
月的材料得到液泡。×800 
a The free vacuoles in the coltares preserved for 
4 mol山S and 】4da3,s； The aged and vacuolaled 
lrlch~ e；c．The vacuoles isolated hypotonic 
enzymolysis from the ttichome cells grown for I 
mollth ×804) 
各 自的缺点，采取低渗酶解和渗透冲击相结合的方法处理，结果，从培养 3d的年轻培养物 
也得到液泡。采用这种方法处理培养 3d的材料，50％以上细胞破裂，1 5％以上的破裂细胞 
释放液泡，结果完全可靠。在这一试验中，液泡在低渗条件下吸水膨胀，突破降解细胞的 
残壁而成为可见液泡。如果液泡不够大，可能仍包藏在细胞中不能游离出来。因此，已经 
形成液泡的细胞应远在 1 5％之上。究竟有多少细胞形成了液泡，是否实际上每个细胞都 
含有液泡，这一点还有待深人研究。 
对经无机盐诱导产生液泡，人们可能提出疑问，认为这是一种不正常现象，并非蓝藻 
本身就含有液泡。上述试验结果则完全可以消除这种疑 问，证明液泡是蓝藻细胞的一种 
固有结构，在细胞发育的一定阶段形成。Cocking在植物原生质体和液泡分离的经典工作 
中就发现，根尖分生组织形成无液泡的原生质体，其他区域的细胞形成含液泡的原生质 
体。因此，蓝藻细胞也应存在相似的阶段，某种阶段没有液泡，越过这一阶段，液泡出现。 
因此非诱导液泡的发现同时也修正 了过去那种认为形成液泡表明细胞频临死亡的观点。 
至于蓝藻液泡是否也像真核生物液泡那样具有多方面功能、这一点尚待进一步研究。 
蓝藻的诱导液泡和非诱导液泡具有完全相同的性质，只是分离率不同。在诱导条件 
下，几乎每个细胞可产生一个液泡。而不经无机盐诱导时，能分离到液泡的细胞是少数 
液泡的诱导可能只是刺激幼小的液泡发育成长而已。初步实验注意到，液泡分离率与藻 
龄相关，藻龄短的液泡分离率低，高龄藻液泡分离率高。 
迄今，在所试验的五个属十余种蓝藻都发现了液泡 可见蓝藻存在液泡是普遍的 蓝 
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366 水 生 生 物 学 报 23卷 
藻液泡的重新发现和分离具有重要意义。第一，由于蓝藻有液泡，使得蓝藻和植物之间的 
亲缘关系更为密切，而使蓝藻和细菌之间增加了一条鲜明的分界线，这将对蓝藻的分类地 
位、不同生物之间的演化关系及演化途径等问题产生影响 蓝藻液泡的存在使蓝藻成为 
植 物 和 细 菌 之 间 的 一 个 中 间 类 型 ，为 此，建 议 给 蓝 藻 这 样 一 个 新 名 称 ：蓝 藻 菌 
(Cyanophytomyces)即相当于放线菌位于细菌和真菌之间那种位置 同时，蓝藻液泡和植 
物液泡的同源性为探讨两者的亲缘关系提出了一个新的方向。第二，蓝藻液泡给蓝藻研 
究提出了一个新的研究对象，对于深人研究蓝藻细胞的结构功能，细胞的发育分化及基因 
表达控制等提出了新的思路。这包括液泡内含物成分及由此显示的功能，与液泡形成相 
关的细胞阶段划分，液泡的起源发生，诱导液泡的机理，诱导和非诱导液泡的异同等相当 
广泛的内容 第三，由于蓝藻液泡突出的耐低渗、高度稳定．易融合、吞噬能力强等特点， 
蓝藻液泡可能作为细胞工程的有用工具而得到应用。 
参 考 文 献 
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4期 郭厚 良等：鱼腥藻PCC7120细胞液泡的初步研究 367 
A PRELIMINARY 5’1’UDY 0F THE VACU0LES OF CELLS IN A 
BLUE—GREEN ALGAL ^ 、 PCC7120 
Guo Houliang，Jin Chuanyin”，Pu Qiuwen, 
Song Wet3zhen，Z2~ou Yunzhen and Yang ngping 
(Colege of Science,~~bhan UniversiO,',I~han 430072) 
(Ins6mte。， drobielofy， P Chines~Academy of Sciences．t~han 430072) 
Abstract There were a lot of free vacuoles to have been examinated in the liquid 
cultrues which had been preserved for over 3 months． Th e vacuoles were typicaly 
spherical， fully transparent and varied in size． The gian t vacuoles showed a 
phagocytosis and there were many aged cels to be engulfed by them．Both the aged 
and nonaged cells which were grown for 3 months，2 months， l mol饥 l8 days，l0 
days an d 3 da ys could also be able to release vacuoles in the isolation experiments． 
Three methods， enzymolysis in hypotonic condition, osmotic shock an d hypotoulc 
enzymolysis—osmotic shoc k, were used for the isolation of vac uoles． Over l 5％ of 
cells which were grown for 3 days could releas e vacuoles in the expe riments 
Key words Anabaena sp．PCC7120，Vacuoles 
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鱼腥藻PCC7120细胞液泡的初步研究

http://ir.ihb.ac.cn/bitstream/152342/3928/3/%e9%b1%bc%e8%85%a5%e8%97%bbPCC7120%e7%bb%86%e8%83%9e%e6%b6%b2%e6%b3%a1%e7%9a%84%e5%88%9d%e6%ad%a5%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf

鱼腥藻PCC7120细胞液泡的初步研究

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