Characterization of the molecular mechanisms underlying interaction of cells with the fibrin sealant matrix

Abstract

Wundheilung ist ein komplexer Prozess mit streng regulierten Mechanismen zur Minimierung des Blutverlusts und zur Rekonstruktion des beschädigten Gewebes. In diesem Prozess spielen verschiedene Zelltypen eine Rolle, wie Endothelzellen, Fibroblasten oder Keratinozyten. Diese Zellen interagieren mit dem primären Thrombus, eine Matrix aus großteils quervernetzten Fibrinfasern, der als erstes Grundgerüst für die einwandernden Zellen dient. Die Interaktionen der Zellen mit diesem Gerüst sowie die Einwanderung der Zellen aus der Gewebeumgebung in diese Matrix stellen eine essentielle Phase der Wundheilung dar. Während dieses Schrittes wird die Fibrinmatrix abgebaut und durch gesundes, körpereigenes Gewebe ersetzt. Fibrinkleber sind als Hämostat in unterschiedlichen chirurgischen Indikationen sowie als Kleber für weiches Gewebe (soft tissue) etabliert. Sie haben gezeigt, dass sie verschiedene Aspekte der Geweberegeneration unterstützen wie etwa Zellmigration oder Reepithelialisierung – ähnlich wie der physiologisch gebildete Blutklot. Fibrinkleber bestehen großteils aus konzentriertem Fibrinogen und Thrombin humanen Ursprungs. Diese beiden Komponenten werden kurz vor der Applikation vermischt. Wegen unterschiedlicher Herstellungsverfahren besitzt jedes Produkt seine eigene charakteristische Formulierung. Unterschiede gibt es z.B. in Konzentrationen von Thrombin, Fibrinogen, Salzen oder Molekülen der extrazellulären Matrix (ECM). In aktuellen klinischen Studien wurden Fibrinkleber auch als Matrix zur Unterstützung der Wundheilung verwendet. Daher untersuchten wir, welche die wichtigsten Komponenten der Fibrinmatrix für optimale Interaktion mit Zellen sind. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie sich in der Fibrinmatrix vorhandene Proteine auf Zell-Matrix-Interaktionen auswirken. Zuerst wurden zwei kommerziell erhältliche Fibrinkleber (Artiss und Evicel) mittels in vitro Zelltests auf deren Kompatibilität mit humanen epithelialen Keratinozyten (NHEK) untersucht. NHEK, die mit Evicel und dessen höherer Thrombinkonzentration in Kontakt gebracht wurden, zeigten weniger Adhäsion und Viabilität, eine degenerierte Morphologie, sowie einen höheren Prozentsatz an toten Zellen. Aufgrund der nicht-kovalenten Bindung von Thrombin an Fibrin während der Klotentstehung, wurden die Auswirkungen von fibringebundenem Thrombin auf die Zellviabilität getestet. Anfangs wurde die Aktivität von Thrombin in drei verschiedenen, kommerziell erhältlichen Fibrinklebern gemessen. Mit dieser Information wurden Fibrinklots mit Thrombinkonzentrationen von 4 IU/ml bis 820 IU/ml hergestellt, die sich aber in allen anderen Zusammensetzungen nicht unterschieden. Diese Klots wiesen keine Unterschiede in der Ultrastruktur auf. Bei jenen mit hoher Thrombinkonzentration (820 IU/ml) zeigten NHEK eine schlechtere Adhäsion und weniger Zellspreitung. Die Anzahl der anhaftenden Zellen an den Hochthrombinklot war signifikant niedriger. Der Grund für diese Beobachtungen war nicht nur weniger Proliferation der Zellen, sondern auch erhöhte Apoptose durch maßgeblich verstärkte Expression von Caspase 3 und 7 in Zellen, die auf den Klots mit 820 IU/ml wuchsen. Dies ging einher mit der Induktion der Expression von Trail-R2, ein wichtiger Rezeptor im Apoptosesignalweg. Wurde Thrombin mittels Hirudin geblockt, verbesserte sich die Zellmorphologie und eine größere Zahl an Keratinozyten adhärierte am Fibrinkleber. Weiters war die Expression von Caspase 3 und 7 reduziert. Hier wurde zum ersten Mal beschrieben, dass hohe Konzentrationen von Thrombin im Fibrinkleber nicht nur die Proliferation von Keratinozyten hemmt, sondern auch, dass dies zu vermehrter Apoptose von NHEK führt. Darauf aufbauend wurden Fibrinkleber in einem Exzisionswundheilungsmodell in Ratten getestet. Das Ziel der Studie war, verschiedene Fibrinkleber, sowie unterschiedliche Formulierungen, auf deren Effekt auf die Wundheilung von Ratten zu untersuchen. Wunden, die mit einer geringeren Thrombinkonzentration behandelt wurden, zeigten schnelleren Wundverschluss (an den Tagen 3 und 7) und eine geringere Schwere der Wunden (am Tag 7) verglichen mit Wunden, die mit hohen Thrombinkonzentrationen behandelt wurden. Weiters konnte eine geringere Anzahl an funktionellen Gefäßen in Wunden mit Evicel-Kleber gezählt werden. Diese Beobachtung passt zu den Ergebnissen, dass der Level an VEGF in Artiss-behandelten Wunden am Tag 2 höher war. Diese in vivo Resultate können teilweise mit den Beobachtungen zur Zellkompatibilität in vitro erklärt werden. Darüber hinaus zeigte eine Untersuchung des Fibrinabbaus, dass der Artiss-Klot nach zehn Tagen resorbiert wurde, der Evicel-Klot nach 15 Tagen. Als weiteren Aspekt wurde die Auswirkung von Fibronektin auf Zell-Matrix-Interaktionen untersucht. Da Keratinozyten keinen Integrinrezeptor ανβ3 exprimieren und dadurch nicht direkt an Fibrin binden können, spielen andere ECM-Moleküle wie Fibronektin eine wichtige Rolle in der Zelladhäsion. NHEK zeigten eine schlechtere Anhaftung an den Klot und eine degenerierte Morphologie am Fibrinkleber mit reduzierter Fibronektinkonzentration. Diese Resultate konnten durch Zugabe von Fibronektin in den Klot verbessert werden. Darüber hinaus wurde die Auswirkung von anderen Bestandteilen des Fibrinklebers auf die Klotstruktur und Zellkompatibilität untersucht. Durch Veränderung der Salzkonzentration oder die Verwendung von Fucoidanen anstelle von Thrombin konnte die Struktur des Klots signifikant modifiziert werden. Trotzdem blieb die Zellkompatibilität unverändert. Dies legt nahe, dass die Struktur nicht so wichtig für Zell-Matrix-Interaktionen ist wie die Zusammensetzung bestimmter Inhaltsstoffe der Matrix. Fibrinkleber sind wichtige und gut etablierte Werkzeuge in der Chirurgie. Das Ziel dieser Doktorarbeit ist, die Prinzipien und Signalwege der Zell-Matrix-Interaktionen besser zu verstehen. Eine Anzahl an Studien wurde durchgeführt um die Zusammensetzung und Charakteristik von Fibrinklebern zu optimieren und dadurch ein Produkt zu entwickeln, das chirurgischen Ansprüchen entspricht und Produktsicherheit gewährleistet. Die Ergebnisse dieses Projekts sollen zu einer weiteren Verbesserung der Fibrinmatrix führen- zur Unterstützung der Geweberegeneration.Wound healing is a complex process with strictly regulated mechanisms to minimize blood loss and to reconstruct the damaged tissue. In this process several cell types such as endothelial cells, fibroblasts, and keratinocytes interact with the primary thrombus that basically consists of a matrix of cross-linked fibrin fibers serving as scaffold for invading cells. Following the initial hemostasis, interaction with this scaffold and ingrowth of cells into the fibrin matrix from tissue surrounding the wound bed is essential for the subsequent stages of the wound healing process. By this process fibrin matrix is degraded and finally replaced by healthy tissue. Fibrin sealants are widely used as hemostats in various surgical indications and for sealing of soft tissue. Fibrin sealants have also been shown to promote different aspects of tissue regeneration such as cell migration and re-epithelialization in a similar way as their physiological counterpart, the blood clot. Fibrin sealants mostly consist of plasma derived concentrated fibrinogen and thrombin solutions that are mixed immediately before application. Due to different purification procedures each product has its characteristic formulation. Differences exist e.g. in the concentration of thrombin, fibrinogen, salts or ECM molecules. In recent clinical studies fibrin sealants have been used as a matrix to promote wound healing. This raised our interest to examine what are the most important components of a fibrin matrix for optimal interaction of the extracellular matrix with cells. In this thesis, we investigated how the presence of proteins present in fibrin sealant affects cell-matrix interaction. First we characterized two commercially available fibrin sealants Artiss and Evicel in their compatibility with normal human epithelial keratinocytes by several in vitro cell assays. NHEK grown on Evicel with its higher thrombin concentration showed less cell adhesion and viability, deteriorated cell morphology and a higher percentage of dead cells. Due to the non-covalent bonding of thrombin to fibrin during fibrin clot formation, we wanted to evaluate the impact of fibrin bound thrombin on cell viability. Initially, we quantified the activity of thrombin in 3 different, commercially available fibrin sealants. This information was used to prepare fibrin clots covering a range of thrombin concentrations from 4 IU/ml to 820 IU/ml, but which were identical with respect to all other constituents. Although these fibrin clots did not differ in their three-dimensional structure, clots prepared with highly concentrated thrombin (820 IU/ml) failed to support adhesion and spreading of primary human keratinocytes (NHEK). The number of attached cells was also significantly reduced on high thrombin activity clots. We hypothesized that these observations are not only the consequence of decreased proliferation but of apoptotic mechanisms, since the expression of cleaved caspase 3 and 7 was strongly enhanced on fibrin clots with high thrombin activity. This was accompanied by an induction of expression of Trail-R2 which is a receptor known to mediate apoptosis signals. Blocking of thrombin activity by hirudin led to an improvement of cell morphology and to an increase in number of attached cells. In addition, the induction of caspase 3 and 7 was also reduced. Thus, here we report for the first time that fibrin bound thrombin does not only decrease proliferation, it also does induce NHEK apoptosis when present at high concentrations. As a consequence and to confirm our in vitro data, fibrin sealants were tested in an excisional wound healing model in rats. The objective of this study was to compare the different fibrin sealants and formations regarding their effects on cells and wound healing in vivo. We found a more rapid wound closure (day3 and day7) and less wound severity (day 7) with sealants containing a lower concentration of thrombin compared to wound healing with high thrombin formulations. Furthermore, less new built functional vessels were counted in Evicel treated wounds after seven days which fits to the result that a lower level of VEGF was expressed after two days in such treated wounds. These in vivo results may be partially explained by the biocompatibility data found in vitro. At last, also fibrin degradation was observed: in animals treated with Artiss, the sealant was lysed after ten days compared to Evicel that needed 15 days. In addition to that, we analyzed the influence of fibronectin on cell-matrix interaction. Since keratinocytes lack of integrin αvβ3 and therefore are not able to bind directly fibrin, other ECM molecules like fibronectin are important for keratinocyte adhesion. We could show that on fibrin sealants depleted of fibronectin, NHEK had less adherence and poor cell morphology and these observations could be improved by addition fibronectin. Moreover, the influences of constituents on clot structure and further consequences on cell compatibility were observed. By changing the salt concentrations or other constituents (fucoidans instead of thrombin) the clot structure could be modified significantly. Nevertheless, cell compatibility remained unchanged upon structure is not so important for cell-matrix interaction as ingredients and constituents of the matrix. Fibrin sealants are important and well established tools in surgery. The aim of this thesis is to help to further understand the principles and pathways of cell-matrix interaction. Numerous studies have been performed to optimize compositions and characteristics of fibrin clots to develop a product which serves clinical requirements and product security guidelines. The results of this project may lead to create a further improved fibrin matrix which activates and promotes tissue regeneration