Das selbst-spleißende Sc. Gruppe II Intron ai5gamma stellt seit Langem ein überaus wichtiges und mächtiges Modelsystem für RNA Faltung in vitro dar. Wie für alle anderen RNAs, spielen Metall Ionen eine entscheidende Rolle im ai5gamma in vitro Faltungsprozess und in den Hefemitochondrien. Im Gegensatz zu den vorherrschenden intrazellulären Ionenkonzentrationen, ist ai5gamma in vitro auf hohe Salzkonzentrationen angewiesen um den selbst-spleiß Prozess durchzuführen. Besonders die Komprimierung des Introns ist limitiert von der Formation eines instabilen Faltungsintermediates, welches durch die Bindung von Mg2+ Ionen stabilisiert wird. Mg2+ Ionen sind bekannt dafür eine überaus wichtige Rolle in der Förderung des langsamen ai5gamma Faltungskollapses in vitro zu spielen. Es wurde beobachtet, dass eine kernkodierte DEAD-box Helikase, welche als Spleißfaktor für alle mitochondrialen Introns in Hefe dient, die Mg2+ Anforderung in vitro auf zelluläre Konzentration senken kann. Kürzlich wurde Mss116p die Funktion zugewiesen, die Komprimierung von ai5gamma in vitro zu beschleunigen. Deshalb sind wir überaus interessiert daran, ob Mss116p den Intron-Faltungsprozess über die Stabilisation des instabilen geschwindigkeitsbeschränkenden Faltungsintermediates stimuliert. Um dieses Ziel zu erreichen muss zuerst rekombinantes Mss116p Protein hergestellt werden. Nach Entwicklung eines adäquaten Expressions- und Aufreinigungsprotokolls wird Mss116p auf die Aktivität und Funktionalität überprüft. Im Detail zeigen wir, dass Mss116p im Stande ist ATP, in Abhängigkeit von RNA, zu hydrolysieren und dass es den ai5gamma Gruppe II Intron Selbst-Spleiß-Prozess unter beinah-physiologischen Ionenkonzentrationen und Temperaturbedingungen fördert. Zuletzt wurde eine Methode entwickelt um die Struktur von ai5gamma in Ab- und Anwesenheit von Mss116p in vitro zu ermitteln wobei wir Metall-Ionen-induzierte Schnitte als mächtiges Instrument zur Hilfe nehmen. Unsere bislang erlangten Daten deuten auf weitere wichtige Optimierungsschritte der Tb3+ Schnittbedingungen hin um die Metall-induzierten Schnittstellen über eine Reverse Transkription visualisieren zu können.The self-splicing Sc. ai5gamma group II intron has long been a powerful and representative model to study RNA folding in vitro. Like for other RNAs, metal ions play an essential role for ai5gamma folding in vitro and in yeast mitochondria. In contrast to the intracellular ionic concentrations, the ai5gamma intron depends on high salt conditions for splicing in vitro. Specifically, compaction is limited by the formation of an unstable folding intermediate that is captured by the binding of Mg2+. Mg2+ ions are known to play a crucial role in promoting the slow collapse of the ai5gamma ribozyme in vitro. It has however been observed that the nuclear-encoded DEAD-box helicase, which serves as a splicing factor for all yeast mitochondrial introns, is able to lower the Mg2+ requirements in vitro to near physiological concentrations. Since Mss116p has recently been described to accelerate the compaction of the ai5gamma intron in vitro, we are interested in understanding whether Mss116p is able to stimulate intron folding by stabilizing the unstable, rate-limiting folding intermediate. The first step to accomplish this goal was to produce recombinant Mss116p protein. After establishing an appropriate expression and purification protocol for Mss116p we analyzed whether the recombinant protein is active. In particular, we demonstrated that the recombinant Mss116p is capable of hydrolyzing ATP stimulated by RNA and it promoted group II intron self-splicing at near-physiological ionic and temperature conditions, leaving little doubt to be a fully functional protein. At last, we established a method to probe the ai5gamma intron structure in the absence and presence of Mss116p in vitro employing a metal ion-induced cleavage assay. Our preliminary data suggest further optimization of the Tb3+ induced cleavage assay is necessary in order to map metal-induced cleavage sites by means of reverse transcription and eventually to understand the role of Mss116p in the collapse of the ai5gamma intron
