Diese Dissertation wurde an der Universität Wien in den Max F. Perutz Laboratories von Mag. Mads Beich-Frandsen von 2005 bis 2011 durchgeführt und betreut von Prof. Kristina Djinović-Carugo vom Department für Strukturbiologie und Computational Biology in Kollaboration mit Prof. Udo Bläsi vom Department für Mikrobiologie, Immunbiologie und Genetik.
Der Titel verweist auf die strukturbiologischen Untersuchungen am RNA-bindenden Protein Hfq aus Escherichia coli. Durch die Erkenntnis, dass nur ein Bruchteil des gesamten Genoms für Protein kodiert, verlagerte sich der Forschungsschwerpunkt in der Biologie hin zu RNA-basierter Regulation. Mit der wachsenden Anzahl vollständiger Transkriptomprofile kristallisiert sich das Sm-like Protein Hfq als zentrale Schaltstelle zur Genregulation durch small regulatory RNAs (sRNAs) in Bakterien heraus.
In E. coli und anderen gram-negativen Pathogenen ist der konservierte Sm-like Kern von Hfq um eine carboxyterminale Domäne erweitert, deren Länge 30% der Sequenz des gesamten Proteins beträgt. Seine kurze aminoterminale Region ist hingegen in höherem Maße konserviert. Sowohl N- als auch C-Terminus von Hfq, beide gekennzeichnet durch intrinsisches Fehlen einer geordneten Struktur, tragen nachweislich zur Funktionalität des Proteins bei. Der Schlüsselmechanismus der Hfq-vermittelten Regulation besteht darin, transkodierte sRNAs mit ihrer Ziel-mRNA zu hybridisieren. Hfq agiert somit als RNA-Chaperon, welches die Sekundärstruktur von RNA modifiziert.
Die Aufgabenstellung des Projekts bestand darin, die Funktion von Hfq aus einer strukturbiologischen Perspektive zu beleuchten. Im Rahmen dieser Forschungsarbeit wurden Röntgenkristallographie, Kleinwinkelstreuung, NMR Spektroskopie, Zirkulardichroismus mit Synchrotronstrahlung, kombiniert mit und integriert in bioinformatische und funktionelle Studien, angewendet.
Aus dieser Arbeit gingen zwei Publikationen hervor, die strukturelle Aspekte von Hfq in E. coli beschreiben. Die Analyse jener Ergebnisse geschah im Kontext biophysikalischer und funktioneller Resultate, welche den intrinisch unstrukturierten Termini von E. coli Hfq Funktionalität zuweisen. Es konnte festgestellt werden, dass die Termini, ausgelöst durch die Interaktion mit RNA, Strukturen ausbilden. Die Interpretation dieser Resultate folgt dem „Entropietransfermodell“, welches vorschlägt, dass intrinisch unstrukturierte Sequenzen durch isothermische Enthalpie/Entropie-Kompensation die Entfaltung von Zielstrukturen begünstigen können.
Das Zusammenspiel von strukturierter und ungeordeter Sequenz in E.coli Hfq ermöglicht es diesem Protein, mit einer Vielzahl an RNAs zu interagieren und diese zu regulieren. Die zentrale Funktion von Hfq ist hierbei, die RNA in einem ungefalteten Zustand zu erhalten. Sie kann in folgendem Dogma zusammengefasst werden: Bindung fördert Entfaltung – Entfaltung fördert Hybridisierung - Hybridisierung fördert Loslösung von Hfq!This dissertation was conducted at the University of Vienna, Max F. Perutz Laboratories in the years 2005-2011. Here is reported on research performed by Mag. Mads Beich-Frandsen, supervised by Prof. Kristina Djinovic-Carugo at the Department of Structural and Computational Biology, in collaboration with Prof. Udo Bläsi at the Department of Microbiology, Immunobiology and Genetics.
The title refers to the biostructural investigations conducted for the RNA-binding protein Hfq from Escherichia coli. Upon the understanding that only a fraction of a genome encodes protein, focus has been shifted to RNA-based regulation in biology. With the increasing number of transcriptome profiles being completed, the Sm-like protein Hfq emerges as the central switchboard of gene regulation, as mediated by small regulatory RNAs (sRNAs) in Bacteria.
In E. coli and other gram-negative pathogens, the conserved Sm-like core of Hfq is extended 30% in sequence length, by a C-terminal domain. The short N-terminal region of Hfq is conserved to higher degree. Both the N- and C-terminus of Hfq have been demonstrated of functional importance for the protein, and are characterized as intrinsically disordered. The key mechanism of Hfq-mediated regulation is by annealing trans-encoded sRNAs to target mRNA. Here Hfq acts as an RNA-chaperone, with ability to alter the secondary structure of RNA.
The scope of the project was to elucidate the function of E. coli Hfq from the perspective of structural biology. The research presented here employs X-ray crystallography, Small Angle Scattering, Nuclear Magnetic Resonance, Synchrotron-Radiation Circular-Dichroism, in an integrated approach with bioinformatics and functional studies.
The work resulted in two publications, reporting on structural aspects of E. coli Hfq. These results were analyzed in context of acquired biophysical and functional results, which annotates function to the intrinsically disordered N- and C-terminus of E. coli Hfq. Interaction with RNA was found to induce structure upon the termini of Hfq. This was interpreted in line of the ‘entropy-transfer’ model, which proposes intrinsically disordered sequence to have a function in unfolding targets by isothermal entropy/enthalpy compensation.
The interplay between the structured and disordered sequence in E. coli Hfq provides the protein with the ability to interact with and exert regulation on a wide variety of RNAs. Hfq functions to keep the RNA unfolded, following the dogma: Binding promotes unfolding – unfolding promotes annealing – annealing promotes release of Hfq
