Der biogeochemische Stickstoff-Kreislauf ist von enormer Bedeutung für die Biosphäre, da das Element Stickstoff für alle Organismen lebensnotwendig ist. Aus diesem Grund heraus wurde seit mehr als einem Jahrhundert intensiv an jenen Mikroorganismen geforscht, die für die Um-wandlung von Stickstoffverbindungen veranwortlich sind. Doch bis heute gibt es noch viele zu klärende Fragen, was diese Prozesse betrifft. Diesbezüglich ist vor allem der Prozess der Nitrifi-kation von besonderem Interesse, da gerade in Bezug darauf innerhalb des letzten Jahrzehnts viele neue Erkenntnisse gewonnen wurden. Die Nitrifikation ist jener Teil des Stickstoff-Kreislaufes, in dem Ammonium/Ammoniak zu Nitrat oxidiert wird.
Diese Diplomarbeit fokussierte sich auf die weitere Erforschung der Gattung Nitrospira, einer Gattung von Nitrit-oxidierenden Bakterien (NOB), welche den zweiten Schritt der Nitrifikation – die Oxidation von Nitrit zu Nitrat - durchführen. Ziel dabei war es einerseits, mehr über die Ökophysiologie dieser Mikroorganismen sowie andererseits mehr über ihre temporäre Vertei-lung in der Kläranlage der Veterinärmedizinischen Universität Wien in Erfahrung zu bringen.
Das Schlüsselenzym für die Oxidation von Nitrit ist das membranassoziierte Enzym Nitrit-Oxidoreductase (Nxr). Jene Gene, welche dieses Enzym codieren, liegen im Genom von “Can-didatus Nitrospira defluvii“ (Ca. N. defluvii), einer Art der sublineage I der Gattung Nitrospira, in jeweils zwei paralogen Kopien vor. Jene beiden paralogen Gene, welche die alpha-Untereinheiten codieren, unterscheiden sich dabei deutlich voneinander. Da diese Untereinhei-ten für die Substratbindung verantwortlich sind, könnte dies auf unterschiedliche Substrat-Affinititäten hindeuten. Daher fokussierte sich der erste Teil dieser Studie darauf, die Expressi-on dieser alpha-Untereinheiten unter unterschiedlichen Nitritkonzentrationen zu untersuchen, um so eine mögliche Substrat-abhängige Regulierung dieser Gene aufzeigen zu können. Dafür wurde eine qPCR-Methode entwickelt, welche spezifisch die Expression dieser beiden Gene detektieren kann. Erste Experimente stützen die Hypothese, dass eines der beiden Gene konsti-tuitiv exprimiert wird, während die Expression des zweiten Gens bei einer Nitrit-Konzentration von 3 mM hochreguliert wird. Dies entspricht jener Konzentration, bei der Ca. N. defluvii die höchste Nitrit-Oxidationsrate aufweist. Weiters kann mit der entwickelten qPCR-Methode auch getestet werden, ob eines der beiden codierten Nxr-Enzyme auch den reversen Schritt - die Re-duktion von Nitrat zu Nitrit - katalysieren kann. Dies konnte zuvor schon für das Nxr-Enzym von anderen Organismen gezeigt werden. Erste Versuche konnten diese Hypothese jedoch nicht stützen.
Eine weitere Arbeit dieser Diplomarbeit beschäftigte sich mit der Untersuchung eines möglichen mixotrophen Lebensstils von Ca. N. defluvii. Um dies zu untersuchen sollte die Expression des Enzyms Citrat-Synthase untersucht werden. Dieses Enzym ist essentiell im oxidativen Tricar-bonsäurezyklus (Krebs-Zyklus, Zitronensäurezyklus). Ob dieser in Ca. N. defluvii funktionell ist, konnte bislang noch nicht gezeigt werden. Deshalb wurde auch für das Gen gltA, welches die Citrat-Synthase codiert, eine qPCR-Methode entwickelt. Diese ermöglicht den Nachweis der Nutzung von organischen Verbindungen über den Tricarbonsäurezyklus, wenn eine erhöhte Ex-pression dieses Gens nachgewiesen werden kann. Aufgrund von Biomasselimitierung konnten diesbezüglich jedoch keine spezifischen Untersuchungen durchgeführt werden. Diese könnten jedoch Gegenstand von zukünftigen Experimenten sein, bei denen Anreicherungskulturen von Ca. N. defluvii unter oxischen Bedingungen mit bestimmten organischen Verbindungen inku-biert werden könnten. Ergebnisse aus diesen Untersuchungen könnten Hinweise für die weite Verbreitung sowie die Dominanz der Gattung Nitrospira in Kläranlagen aufgrund von mögli-chen Präferenzen bezogen auf verschiedene organische Verbindungen liefern.
Ein weiterer Teil dieser Diplomarbeit befasste sich mit der Verbreitung von Populationen der Gattung Nitrospira in der Kläranlage der Veterinärmedizinischen Universität Wien. Dabei wur-den die Häufigkeiten verschiedener nahverwandter Subpopulationen der sublineage II der Gat-tung Nitrospira basierend auf ihren Biomasseanteilen untersucht. Um diese zu erheben wurde die Methode Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) in Kombination mit Konfokalmikrosko-pie sowie der Quantifizierungssoftware daime eingesetzt. Die durchgeführten Erhebungen zeig-ten, dass sublineage II-angehörige Populationen der Gattung Nitrospira in dieser Kläranlage höchstabundant waren. Innerhalb dieser sublineage II konnte weiters eine stabile Koexistenz von zwei Subpopulationen über den gesamten Beprobungszeitraum nachgewiesen werden. Die-se stabile Koexistenz könnte auf verschiedenen physiologischen Anforderungen oder Fähigkei-ten dieser Subpopulationen basieren.
Zusammenfassend konnten neue Einblicke in die Ökophysiologie und die Gemeinschaftstruktur von Nitritoxidierenden Bakterien gewonnen werden, welche wiederum Grundlage für weitere Experimente darstellen. Diese Informationen wiederum sind von enormer Bedeutung, um den Prozess der Nitrifikation in Kläranlagen besser verstehen zu können.The biogeochemical nitrogen cycle is of paramount importance for the biosphere since nitrogen is essential to all organisms. Therefore, microbes participating in this cycle have been investigated for more than one century. But still, much is unknown. Especially the nitrification process - the transformation of ammonia/ammonium to nitrate - is of particular interest since many new aspects have been revealed in the last decade. This study focussed on the further investigation of the genus Nitrospira - a genus of nitrite-oxidizing bacteria (NOB) performing the oxidation of nitrite to nitrate - the second step in the nitrification process. This bacterial genus was investigated concerning its ecophysiology on the one hand and its distribution in the wastewater treatment plant of the University of Veterinary Medicine Vienna on the other hand.
The key enzyme for the oxidation of nitrite to nitrate is the membrane-associated nitrite-oxidoreductase (Nxr) which in ”Candidatus Nitrospira defluvii” - a member of sublineage I of the genus Nitrospira - is present in two copies in the genome. The alpha-subunits of the encoded enzymes differ from each other indicating possible differences of their substrate-affinities. Therefore, the first part of this study focussed on the expression of these alpha-subunits with different nitrite concentrations to reveal a possible substrate-dependent regulation. For this purpose, qPCR assays specific for these genes were developed. First experiments supported the hypothesis that one of the Nxr’s is constitutively expressed, whereas the second copy is upregulated at a nitrite-concentration of 3 mM - the optimal concentration for growth of Ca. N. defluvii. Furthermore, this enzyme was shown to be capable of performing the reverse step - the reduction of nitrate to nitrite - in other organisms. Therefore, the developed qPCR assays were also used to check for the expression of the two encoded Nxr enzymes under denitrifying conditions. First results, however, did not support this hypothesis.
Another part of this thesis tackled to a possible mixotrophic lifestyle of this organism by examining the expression of the enzyme citrate synthase. This enzyme is essential in the oxidative tricarboxylic acid cycle (oTCA), which is yet unknown to be functional in Ca. N. defluvii. To analyze its expression, a qPCR assay specific for the gltA gene encoding the citrate synthase was developed. This assay allows the investigation of Ca. N. defluvii with regard to the use of organic compounds with the oTCA cycle. Future experiments with cultures of Ca. N. defluvii should test the use of different organic compounds after incubating the cultures under oxic conditions. Such data could explain the distribution of this sublineage as well as its dominance in some wastewater treatment plants (WWTPs).
Another part of this study dealt with the distribution of Nitrospira populations in the WWTP of the University of Veterinary Medicine Vienna. Different subpopulations of sublineage II of the genus Nitrospira were examined concerning their abundance in samples taken over six years. For this purpose, fluorescence in situ hybridization (FISH) in combination with confocal microscopy and the image analysis software daime was applied. This study showed that members of sublineage II of the genus Nitrospira are highly dominant in this WWTP. Furthermore, stable coexistence of different subpopulations over the whole sampling period was revealed. This likely is caused by differences in the ecophysiology of the subpopulations which may represent different ecotypes. Due to different physiological demands or capabilities they could inhabit different niches in WWTP.
Taken together, new insights into the ecophysiology and community structure of nitrite-oxidizing bacteria have been revealed and provide material for further investigations. Such information about the genus Nitrospira is important to better understand the nitrification process in WWTPs
