Das Enzym Chloritdismutase (Cld), eine Oxidoreduktase, katalysiert den Abbau von Chlorit zu Chlorid und molekularem Sauerstoff.Es ist hiermit eines von drei bekannten Enzymen, welches die Bildung einer molekularen Sauerstoffbindung als primäre Funtion durchführt. Ursprünglich waren Clds nur aus Perchlorat-respirierenden Bakterien (PCRB) bekannt, wo sie die Selbstvergiftung der Bakterien durch Abbau von cytotoxischem Chlorit, welches als Produkt der (Per)chloratreduktion entsteht, verhindern. Belastung des Trinkwassers durch anthropogenes (Per)chlorat wurde in den letzten 50 Jahren zu einer zunehmenden Bedrohung der öffentlichen Gesundheit in den Vereinigten Staaten. Bioremediation wäre ein geeignetes Mittel zur Entgiftung.
Im Jahr 2008 wurden Cld - Homologe nicht nur in PCRBs, sondern in einer Vielzahl von Bakterien- und Archaeenstämmen entdeckt. Sie bilden nun die Chloritdismutase-Überfamilie, deren Mitglieder CFPs (Chlorite dismutase family proteins) genannt werden. Nur ein kleiner Anteil dieser katalysieren den Abbau von Chlorit; die Funktion der meisten ist noch unbekannt, auch wenn z.B. das CFP aus L. monocytogenes essentiell für das Pathogen ist und damit einen Ansatzpunkt für Medikamentenentwicklung bieten könnte.
Um Chloritdismutaseaktivität in sequenzbasiert in CFPs vorhersagen zu können, wurden konservierte und teilweise konservierte Aminosäurereste identifiziert und als mögliche Signaturreste für Cld-Aktivität vorgeschlagen. In dieser Arbeit wurden diese Aminosäurereste in der Cld von Candidatus Nitrospira defluvii, eines wichtigen nitrifizierenden Klärbakteriums durch ortsspezifische Mutagenese ausgetauscht. Die Mutanten wurden durch biochemische Enzymaktivitätsmessungen und Röntgenkristallografie charakterisiert. Die wichtige Rolle des zuvor identifizierten Aminosäurerests Arginin 173 wurde nochmals bestätigt und erweitert. Für elf Mutanten und eine Cobalt Protoporphyrin IX Variante wurden Fliessgleichgewichtskinetiken gemessen und die Struktur vierer Mutanten sowie der apo-Variante von NdCld wurde durch Röntgenkristallografie gelöst. Des weiteren wurde die Relevanz elektostatischer bzw. hydrophober Interaktionen, welche zur Stabilität der dimeren Chloritdismutase von Nitrobacter winogradskyi beitragen, untersucht.The enzyme chlorite dismutase (Cld), a heme b binding oxidoreductase, catalyzes the degradation of chlorite to chloride and molecular oxygen. It is therefore one of three known enzymes catalyzing the formation of a molecular O-O bond as its primary function. Clds were originally thought to be present in (per)chlorate respiring bacteria (PCRB), where they prevent self-toxification of the bacteria by degradation of cytotoxic chlorite, which is formed as a product of (per)chlorate reduction. Because freshwater pollution by anthropogenic perchlorate has become a serious public health threat in the United States, bioremediation would present an efficient method of detoxification.
In 2008, many homologues to Cld were discovered not only in PCRBs, but in a large number of diverse bacterial and archaeal phylae. They comprise now a chlorite dismutase superfamily, whose members are called CFPs (Chlorite dismutase family proteins). Only a small subset of those were found to degrade chlorite, the function of the large moiety remains unknown, though e.g. the CFP from L. monocytogenes was shown to be essential for the organism, making the protein a suitable drug target.
To predict chlorite dismutase activity in CFPs on a sequence basis, conserved and partially conserved residues were previously identified and suggested as possible signature residues for Cld activity. In this work, these residues in the active site of the Cld from Candidatus Nitrospira defluvii (NdCld), a key nitrifier in wastewater treatment, were exchanged by site-directed mutagenesis and the mutants characterized by biochemical enzyme activity assays (steady-state kinetics) and structurally by X-ray crystallography. The role of the previously identified catalytic residue arginine 173 was confirmed and steady-state kinetics measured for eleven mutants and a cobalt protoporphyrine IX variant of NdCld. The structure of four mutants and apo-NdCld was solved by X-ray crystallography. In addition, the respective contributions of electrostatic and hydrophobic interactions to the stability of the dimer interface in the chlorite dismutase from Nitrobacter winogradskyi were experimentally determined
