Während des Lebens erkrankt durchschnittlich eine von drei Personen an Krebs (Pecorino, 2008) und mehr als 50 % der betroffenen Personen sterben an der Krankheit (Stewart, et al., 2003). Allein diese beiden Fakten zeigen die große Notwendigkeit für Medikamente gegen Krebs auf.
60 % der Medikamente zur Tumorbehandlung stammen von Pflanzen ab, womit Pflanzen eine wichtige Grundlage für die Entwicklung dieser Medikamente bilden (Cragg, et al., 2005). Aus diesem Grund wurden die zwei ethnomedizinischen Pflanzen, die von den Maya in Guatemala verwendet werden, auf ihre anti-neoplastische Wirkung hin untersucht. Ethnomedizinische Pflanzen sind deshalb so wichtig in der Krebsforschung, da diese Pflanzen über Jahrhunderte hinweg gegen verschiedene Krankheiten verwendet wurden (Shoeb, 2006). Die zwei in dieser Studie untersuchten Pflanzen, P. odorata and S. spinosa, wurden ausgewählt, da sie ursprünglich zur Behandlung von Entzündungen verwendet wurden und bei Entzündungen und Krebs ähnliche Signalwege angesprochen werden (Kundu, et al., 2008).
Das Dichlormethan-Extrakt der P. odorata ist bekannt dafür anti-neoplastisch zu wirken, wie Gridling et al. (2009) und Bauer et al. (2010) bereits beschrieben. Deshalb wurde die „Bio-Assay Guided Fractionation“ der P. odorata mit dem Dichlormethan-Extrakt begonnen. Nach vier bzw. fünf Fraktionierungsschritten mit Vakuum-Flüssigkeitschromatographie bzw. normaler Säulenchromatographie, wurden zwei sehr aktive Fraktionen erhalten; F4.6.3 und F5.3.6.7. Zwischen den jeweiligen Fraktionierungsschritten wurde die pro-apoptotische und anti-proliferative Aktivität der Fraktionen an HL-60 Zellen getestet. Die zytotoxischen Effekte dieser zwei Fraktionen waren erheblich, in der Konzentration von 10 µg/ml rief F4.6.3 nach 48 Stunden eine Apoptoserate von 100 % in HL-60 Zellen hervor, F5.3.6.7 von 90 %. Mittels Western Blots wurden diese Effekte weiter analysiert. Hier zeigte F4.6.3 einen etwas stärkeren Effekt auf die γH2AX Aktivierung, welche auf eine höhere Anzahl an DNA-Doppelstrangbrüchen hinweist. Als Konsequenz wurde die Caspase-Kaskade in Gang gesetzt, und der Zellzyklus durch die Phosphorylierung von Chk2 und Cdc2A angehalten. Im Gegensatz zu F4.6.3 zeigte F5.3.6.7 einen größeren Einfluss auf Mobilitätsproteine. F5.3.6.7 verminderte die Expression von Paxillin und ROCK-1 und hemmte die Phosphorylierung von MYPT, welche allesamt für eine Einschränkung der Zellmobilität stehen und damit den Weg für eine Metastasierung erschweren.
Die getrocknete Wurzel der zweiten ethnomedizinischen Pflanze, S. spinosa, wurde zuerst gemahlen und anschließend mit Lösungsmitteln mit steigender Polarität extrahiert. Danach wurden Proliferations- und Apoptose-Assays durchgeführt und das aktivste Extrakt - das Methanol-Extrakt - einer Detannifizierung unterzogen. Nach dem Detannifizierungs-Prozess war die anti-neoplastische Aktivität in der Wasser-Methanol-Fraktion zu finden, in welcher auch die Tannine enthalten sein sollten. Die Tannine konnten jedoch nicht detektiert werden. Die Proliferation von HL-60 Zellen wurde durch die neu erhaltene Wasser-Methanol-Fraktion nach 48 Stunden in einer Konzentration von 60 µg/ml um 40 % gehemmt. Apoptose wurde in der Konzentration von 120 µg/ml nach 48 Stunden in 95 % der HL-60 Zellen induziert. Auf Grund dieses Ergebnisses wurden Onkoproteine, bzw. Proteine die am Zellzyklus oder der Apoptose beteiligt sind, mittels Western Blots näher untersucht. Die Fraktion hatte vor allem großen Einfluss auf Onkogene wie beispielsweise Stat3 und c-Myc. Die Phosphorylierung von Stat3 wurde durch die Wasser-Methanol-Fraktion vermindert, ebenso wie die c-Myc-Expression, welche beide als Indikatoren für abnormales Zellwachstum bekannt sind. Außerdem führte die Fraktion zu Unterbrechungen des Zellzyklus durch verminderte Expression von Cdc25A nach 24 Stunden und erhöhte Expression von p(Ser177)Cdc25A und p21. Ebenfalls wurden Indikatoren für Apoptose durch die Fraktion von S. spinosa beeinflusst. Die γH2AX Expression stieg und zusätzlich wurde die Caspase-Kaskade in Gang gesetzt, bei der es durch Aktivierung von Caspase 8 und 9 zur Spaltung von Caspase 3 kommt. Caspase 3 ist bekannt für die Induktion von Apoptose und für die Aktivierung von PARP, welches ebenfalls ein Apoptose Indikator ist.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass beide untersuchten Pflanzen deutliche anti-neoplastische Effekte in HL-60 Zellen zeigten und deshalb untermauern, dass ethnomedizinische Pflanzen, die seit Jahrhunderten als Medikament gegen Entzündung in Verwendung sind, eine gute Grundlage für die Forschung nach neuen Krebsmedikamenten bilden.The facts that one out of three persons is affected by cancer during their lifetime (Pecorino, 2008) and that more than 50 % of them die from the disease (Stewart, et al., 2003) show that there is a substantial need for anti-cancer drugs.
Plants have been a source of effective drugs for the treatment of cancers, and generally over 60 % of anti-cancer drugs originate from natural sources (Cragg, et al., 2005). For this reason two ethnomedical plants, used by the Mayas of Guatemala, were investigated towards their anti-neoplastic activity. Ethnomedical plants have a large impact in cancer research, because those natural products have been administered as a therapy against several diseases for hundreds of years (Shoeb, 2006). The two plants investigated in this study, P. odorata and S. spinosa, are originally used against inflammation. Reason for the investigation of plants with anti-inflammatory effects is that both, inflammation and cancer up-regulate similar signalling pathways (Kundu, et al., 2008). The dichloromethane extract of P. odorata is already known to contain an anti-neoplastic activity, as described by Gridling et al. (2009) and Bauer et al. (2010). Therefore the bio-assay guided fractionation of P. odorata started with the dichloromethane extract. After four, respectively five steps of fractionation using vacuum liquid chromatography or column chromatography with in-between testing the pro-apoptotic and anti-proliferative effect on HL-60 cells, the fractionation process resulted in two very active fractions; F4.6.3 and F5.3.6.7. The two fractions were then further analysed by western blot analysis with focus on cytotoxic effects. In the concentration of 10 µg/ml both fractions had strong cytotoxic effects. F4.6.3 induced apoptosis by 100 % in HL-60 cells after 48 hours; F5.3.6.7 induced an apoptosis rate of 90 %. The western blot analysis revealed that F4.6.3 was the fraction with the stronger γH2AX activation, indicating DNA-double-strand breaks. For this reason the fraction showed also the activation of the caspase cascade and inhibition of the cell cycle progression by phosphorylation of Chk2 and Cdc25A. In contrast, F5.3.6.7 had a stronger impact on the cell mobility proteins like decreasing the expression of paxillin and ROCK-1. This and the complete inhibition of pMYPT are indicative for decreased cell mobility, decreasing the chance for metastasis.
The air-dried root of the second ethnomedical plant from Guatemala, S. spinosa, was first milled and then extracted by solvents with increasing polarity. Afterwards proliferation and apoptosis assays were conducted. The most active extract, the methanol extract was then subjected to detannification. The anti-proliferative and pro-apoptotic activity was found in the water-methanol layer, which should also include the tannins that however have not been detectible. The extract inhibited proliferation up to 40 % in the concentration of 60 µg/ml and induced apoptosis up to 95 % in the concentration of 120 µg/ml after 48 hours of incubation. Proteins relating cell cycle progression, apoptosis and oncoproteins were investigated by western blotting. The fraction especially had a great impact on oncogenes. It decreased pStat3 as well as c-Myc, which are all indicators for abnormal cell growth. Further the water-methanol fraction led to cell cycle disturbances leading to growth arrest by decreasing the expression of Cdc25A after 24 hours and increasing the level of p(Ser177)Cdc25A and p21. Apoptosis indicating proteins like γH2AX and the caspase cascade including caspase 8, 9 and in the end the cleavage of caspase 3, which itself results in a PARP cleavage were up-regulated by the extract of S. spinosa.
In summary, both investigated plants clearly showed anti-neoplastic effects on HL-60 cells, and therefore confirm that ethnomedical plants, used against inflammation for hundreds of years are suitable to discover novel anti-cancer drugs
