Ziel dieser Diplomarbeit war die Anreicherung der anti-neoplastischen Aktivität der guatemalischen Pflanze Pluchea odorata (L.) Cass., Asteraceae, und die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen dieser Aktivität. Neueste Untersuchungsergebnisse zeigen die starke anti-neoplastische Aktivität der oberirdischen Pflanzenteile dieser traditionellen Heilpflanze, welche bei den Maya zur Behandlung schwerer Entzündungen eingesetzt wird [GRIDLING et al., 2008].
Auf Basis dieser Ergebnisse wurden zur Anreicherung aktiver Verbindungen, Bio-Assay unterstützte Fraktionierungen durchgeführt. Zu Beginn wurde das getrocknete, pulverisierte Pflanzenmaterial mit Hilfe der ASE (accelerated solvent extraction) extrahiert um das bioaktive P. odorata ASE - CH2Cl2 Extrakt zu erhalten. Darauf folgten die Fraktionierungsschritte durch (VLC) Vacuum liquid chromatography (PE,CHCl3-MeOH,MeOH-H2O in unterschiedlichem Mischungsverhältnis), durch (CC) Normal column chromatography (Chloroform-Methanol-Wasser Gradient) auf Silikagel KG60 und durch RP-18 (SPE) Solid phase extraction (CHCl3,MeOH,H2O in unterschiedlichem Mischungsverhältnis). Demzufolge ist die anti-proliferative Aktivität der P. odorata auf eine Fraktion zurückzuführen, welche hoch polare Bestandteile aufweist.
Durch fünf aufeinander folgende Fraktionierungsschritte konnte eine 25-fache Anreicherung der anti-proliferativen Aktivität erreicht werden. Zur laufenden Überprüfung der anti-kanzerogenen Wirkung der erhaltenen Fraktionen wurde die Proliferationshemmung und die Induktion des Zelltodes in HL60 Zellen und MCF7 Zellen getestet. Die wirksamsten Fraktionen waren F2/11, F2/13 und F3/4, welche in der Folge mittels Western blot getestet wurden um zugrunde liegende Mechanismen aufzuzeigen. Die jeweils unterschiedliche Cyclin D1 Expression der einzelnen Fraktionen hat gezeigt, dass die Fraktion F2/11 schwächer wirksame Komponenten enthält als F2/13, und weist zugleich auf eine Aktivitätsanreicherung in Fraktion F3/4 hin.
Die Inkubation der Zellen mit den Fraktionen F2/11, F2/13 und F3/4 löste eine Phosphorylierung von Chk2 am aktivierenden Thr68 aus, wobei Fraktion F2/11 die Chk2 Aktivierung zum frühesten Zeitpunkt auslöste. Die beobachtete Chk2 Aktivität untermauerte den Hinweis darauf, dass sich die aktiven Verbindungen in F2/11 und F2/13 unterschieden. Gleichzeitig zeigte sie deutlich, dass diese Verbindungen, welche vornehmlich in die Zellzyklus-Progression eingegriffen haben, in F3/4 angereichert wurden.
Fraktion F2/11 und F3/4 wiesen die am stärksten pro-apoptotisch aktiven Verbindungen auf, wobei es durch die Fraktionierungsschritte zu einer 45-fachen Anreicherung in Fraktion F3/4 kam. Den Beweis der Genotoxizität der Fraktion F2/11 lieferte die rasch ausgelöste Phosphorylierung von H2AX. Offensichtlich ist in Fraktion F2/11 eine DNA-schädigende Komponente enthalten. Dahingegen fand die Induktion von γH2AX durch F2/13 und F3/4 in Folge der Aktivierung von Caspasen statt, was durch die Aufspaltung von PARP belegt wurde.
Die Acetylierung des alpha-Tubulin hat gezeigt, dass die Mikrotubuli durch alle 3 Fraktionen stabilisiert wurden, und in der Folge mitotischen Arrest und Apoptose auslöste, was an den Mechanismus des Taxol erinnert. Fraktion F3/4 zeigte eine Steigerung der Tubulin-acetylierenden Wirkung. Somit haben wir die Auftrennung und Isolierung von zwei verschiedenen anti-neoplastisch wirksamen Komponenten oder Verbindungsgemischen aus dem P. odorata ASE – CH2Cl2 Extrakt erreicht.The aim of this diploma theses was to enrich the anti-neoplastic activities of Pluchea odorata (L.) Cass., Asteraceae, and analyse the underlying mechanisms. In recent investigations a strong anti-neoplastic activity was found from aerial parts of Pluchea odorata, a plant used by the Maya to treat severe inflammatory conditions [GRIDLING et al., 2008].
Hence, bioassay-guided fractionation was carried out to enrich the active compound(s). Initially the plant material was extracted by (ASE) accelerated solvent extraction obtaining the bioactive P. odorata ASE - CH2Cl2 extract. It was re-chromatographed by (VLC) vacuum liquid chromatography (PE,CHCl3-MeOH,MeOH-H2O in different ratios), normal (CC) column chromatography (chloroform-methanol-water gradient) on silica gel KG60 and RP-18 (SPE) solid phase extraction (CHCl3,MeOH,H2O in different ratios). The bioassay-guided fractionation indicated that the anti-proliferative activity of P. odorata is due to a fraction containing highly apolar constituents.
As a result of five fractionation steps, an at least 25 fold enrichment of anti-proliferative activity was reached. To test the efficiency in anticancer effects the inhibition of proliferation and the induction of cell death were investigated in HL60 cells and MCF7 cells. The most potent fractions F2/11, F2/13 and F3/4 were tested by western blot to obtain evidence of underlying mechanisms. Differences between fractions in Cyclin D1 expression indicate, that F2/11 contains less potent principles than F2/13, but in F3/4 the activity was enriched.
Chk2 was phosphorylated at the activating Thr68 site upon treatment with all three fractions tested. F2/11 induced activation of Chk2 as the earliest of the events. Chk2 activity supported the notion that different active principles were contained in F2/11 and in F2/13, and that those components that more specifically interfered with cell cycle progression, became enriched in F3/4. Fraction F2/11 and F3/4 were the most pro-apoptotic active ones and the pro-apoptotic properties were enriched at least by 45 fold in fraction F3/4. Genotoxicity of fraction F2/11 was indicated by rapidly inducing phosphorylation of H2AX. Apparently, there is a DNA damaging compound in F2/11, whereas induction of γH2AX is the consequence of the activation of caspases by F2/13 and F3/4 as evidenced by PARP cleavage, in which this property was enriched. The acetylation of alpha-tubulin implicated that all three fractions stabilized microtubule, reminiscent of the mechanism of taxol and therefore, trigger mitotic arrest and apoptosis. F3/4 showed an enrichment in the tubulin acetylation property. Thus, we could separate two very distinct anti-neoplastic properties in the fraction of the P. odorata ASE – CH2Cl2 extract