Die detaillierte Charakterisierung der Glykosylierung von Proteinen ist essentiell für die Entwicklung eines umfangreichen Verständnisses dafür, in welcher Vielfalt Oligosaccharidstrukturen vorkommen und wie diese die biologischen Eigenschaften von Proteinen beeinflussen. Die Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) ist eine etablierte Methode zur Untersuchung der Glykosylierungen von Glykopeptiden. Bei MALDI wird die Ionisationsausbeute von Glykanen und kleinen Glykopeptiden in einer Mischung mit nicht-glykosylierten Peptiden gewöhnlich durch Ionisationsunterdrückungseffekte beeinträchtigt. Dies ist beispielsweise bei proteolytischen Verdauen von Glykoproteinen der Fall. Darüber hinaus ist die MALDI-Analyse von sialinsäurehaltigen Oligosaccharidstrukturen durch den labilen Bindungscharakter der Sialinsäurereste eingeschränkt.
Es gibt mehrere Ansätze, um die Probleme der Ionisierungsunterdrückung zu überwinden; der am häufigsten verwendete ist die Trennung der Glykopeptide/Glykane von nicht-glykosylierten Peptiden vor der MS-Analyse. Als ein alternativer Ansatz wird in dieser Arbeit die Entwicklung und Verwendung von ionisch-flüssigen Matrices (ILMs) für die Glykopeptid/Glykan-Analyse in Gegenwart von nicht-glykosylierten Peptiden untersucht. Durch die Kombination von drei konventionellen MALDI-Matrices mit vier verschiedenen organischen Basen wurden zwölf verschiedene ionische Flüssigkeiten synthetisiert und als ILMs angewandt. Als Test-Proben wurden der tryptische Verdau von aus Rinderblutplasma gewonnenem α1-sauren Glykoprotein (entspricht einer typischen Mischung von glykosylierten und nicht-glykosylierten Peptiden) und der gleiche Verdau nach der Behandlung mit einer Endoglykosidase (entspricht einer typischen Mischung von Peptiden und abgespaltenen Glykanen) gewählt. Unter den getesteten ILMs waren Butylammonium-2,4,6-trihydroxyacetophenon (BuA-THAP), N,N,N',N'-Tetramethyl-guanidinium-2,4,6-trihydroxyacetophenon (TGM-THAP) und N,N-α-Diisopropylethyl-ammonium-cyano-4-hydroxycinnamat (DIEA-CHCA) - alle in Kombination mit Diammoniumhydrogenphosphat als Matrix-Lösungszusatz - am besten geeignet, die Ionisierungsunterdrückung von Glykanen und Glykopeptiden in Gegenwart von nicht-glykosylierten Peptiden zu minimieren. Dieses Ergebnis wurde im positiven wie im negativen Ionisationsmodus erzielt und ermöglichte eine erhöhte Peptidsequenz-abdeckung im Vergleich zu herkömmlichen kristallinen Matrices (2,4,6-Trihydroxy-acetophenon (THAP) und α-Cyano-4-hydroxysäure).
Die Glykopeptide wie auch die Glykane konnten mit ausreichend hohen Signalintensitäten für MS/MS-Messungen detektiert werden. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für strukturelle Analysen. Die Abspaltung der labilen terminalen Sialinsäuren konnte durch die Anwendung der ILMs zwar reduziert, aber nicht vollständig verhindert werden. Besonders im negativen Ionisierungsmodus konnten intakte Glykane, an die noch alle Sialinsäuren gebunden waren, nachgewiesen werden.
Die Nachweisgrenzen (LODs) für Glykopeptide in einem Peptid-Gemisch hatten sich im Vergleich zu THAP verschlechtert, für Glykane jedoch stark verbessert. Eine erhöhte Reproduzierbarkeit von Signalintensitäten, die aufgrund der flüssigen Konsistenz der ILMs erwartet werden konnte, wurde nicht beobachtet. Die Suche nach sogenannten "Hot Spots" war nicht mehr notwendig. Dadurch konnten verkürzte Messzeiten erreicht werden.
Zusammenfassend war die Anwendung von ILMs für die MALDI-MS-Analyse von Proteinglykosylierungen geeignet und stellt eine nützliche Alternative zur Anwendung von herkömmlichen kristallinen Matrices dar.In detail characterization of oligosaccharide structures attached to proteins is an essential step in developing substantial understanding in which subtle varieties glycosylation can occur and how it influences biological properties of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) of glycopeptides gained from glycoproteins by enzymatic digestion is an established tool for glycosylation research. For this method, the detection of minor abundant and small glycopeptides and glycans out of the proteolytic digest containing a large amount of non-glycosylated peptides is often impeded by ionization suppression effects. Furthermore, the analysis of sialylated oligosaccharides is limited by the labile nature of sialic acid residues.
There are several approaches to overcome these problems, the most commonly used is the pre-separation of the glycopeptides/glycans prior to MS analysis. As an alternative approach the development and use of ionic liquid matrices (ILMs) as alternative MALDI matrices for glycopeptide/glycan analysis is investigated in this work. Twelve different ionic liquids were synthesized by combination of conventional MALDI matrices with four different organic bases and applied as ILMs. The tryptic digest of bovine α1-acid-glycoprotein (representing a typical mixture of glycosylated and non-glycosylated peptides), and the same digest after treatment with a endoglycosidase (representing a typical mixture of released neat glycans and peptides) were used as test samples. Among the ILMs tested, butylammonium 2,4,6-trihydroxyacetophenone (BuA-THAP), N,N,N´,N´-tetramethylguanidinium 2,4,6-trihydroxyacetophenone (TGM-THAP) and N,N-diisopropylethylammonium α-cyano-4-hydroxycinnamate (DIEA-CHCA), all in combination with di-ammonium hydrogen phosphate as matrix solution additive, were found to be best in overcoming the ionization suppression effects with glycans and glycopeptides in the presence of non-glycosylated peptides. This result was observed in the positive as well as in the negative ionization mode and allowed to attain an increased sequence coverage compared to the use of the common solid matrices α-cyano-4-hydroxycinnamic acid and 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP).
Importantly, glycopeptides and neat glycans were detected with signal intensities sufficient for MS/MS analysis which is an essential requirement for structural analysis. The loss of terminal labile sialic acid groups was reduced when using ILMs, but not completely avoided. Particularly in the negative ionization mode intact glycans with all sialic acids attached could be detected.
The limits of detection (LODs) of glycopeptides in the peptide mixture were worse when comparing to THAP, but strongly improved in the case of cleaved glycans. The expected increase in reproducibility of signal intensities, which should be expected because of the liquid consistency of the ILMs, could not be observed. “Hot spot” selection was not longer necessary, leading to decreased measurement times. In summary, the use of ILMs for the particular purpose of glycosylation analysis of proteins was found being appropriate and useful as an alternative to the use of conventional crystalline matrices
