In dieser Arbeit wurde der „Oxidative Burst“ des angeborenen Immunsystems in der Interaktion mit Candida albicans untersucht. Das klinische Spektrum des opportunistischen Pathogens C. albicans reicht von mucokutanen Infektionen bis hin zu lebensbedrohlichen, systemischen Krankheiten in immunsupprimierten Patienten. Eine der ersten Reaktionen der Zellen des angeborenen Immunsystems, sogenannte Phagozyten, ist die Produktion von Reaktiven Oxygen Spezies (ROS) wenn sie auf Pathogene stoßen. ROS spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungsreaktionen, zum Beispiel zerstören sie eindringende Krankheitserreger. Durch eine Überproduktion von ROS kann aber auch das Endothel beschädigt werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass Zymosan, eine Zellwand Aufbereitung von Saccharomyces cerevisiae, und C. albicans die ROS Produktion in Makrophagen aktivieren. Das C. albicans Genom codiert sechs Superoxid Dismutasen (SOD1 bis SOD6), die an der Zersetzung von ROS beteiligt sind, SOD1 bis SOD3 sind intrazellular und SOD4 bis SOD6 sind wahrscheinlich an der Zellwand von C. albicans lokalisiert.
Diese Arbeit zeigt, dass die Co-Kultur von Makrophagen oder myeloischen dendritischen Zellen mit C. albicans denen Sod5 genetisch entfernt wurde zu einer massiven extrazellulären Anhäufung von ROS in vitro führt. Diese ROS Akkumulierung ist in der Interaktion mit Makrophagen noch höher wenn C. albicans weder Sod4 noch Sod5 haben. Weiteres werden C. albicans Sod5 und Sod4 Mutanten von Makrophagen in vitro besser getötet als Wildtyp C. albicans. Makrophagen, die einen Defekt im Oxidativen Burst haben weil ihnen das gp91Phox Gen fehlt, können diese Mutanten nicht mehr töten, dies zeigt eine ROS-abhängige Eliminierung von pathogenen Pilzen durch Makrophagen. Diese Daten zeigen die physiologische Rolle der C. albicans Zellwand SODs bei der Entgiftung von ROS und weisen auf einen Mechanismus, mit dem C. albicans das Immunsystems in vivo überlistet, hin.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden potentielle Rezeptor(en) untersucht, durch die Makrophagen C. albicans erkennen, um den oxidative Burst zu induzieren. Die Toll Like Rezeptor-Familie und das intrazelluläre MyD88 Adapter-Protein sind nicht an der ROS-Produktion durch Zymosan oder C. albicans Stimulation beteiligt. Wenn der C-Typ-Lectin-Rezeptor Dectin-1 mit Zymosan oder Hitze-getöteter C. albicans stimuliert wird, induziert Dectin-1 die ROS Antwort indem die Src und Syk-Kinase aktiviert wird. Darüber hinaus aktiviert Zymosan auch die ERK1/2 MAP-Kinasen via Dectin-1. Im Gegensatz dazu ist Dectin-1 nur mäßig an der Aktivierung von ROS und ERK1 beteiligt wenn die Makrophagen mit lebenden C. albicans stimuliert werden. Interessanterweise ist die Aktivierung der Src und Syk-Kinasen auch wichtig für ROS Induktion durch Stimulierung mit lebender C. albicans. Dies führt zu dem Schluss, dass ein Rezeptor oder Adapter-Protein mit einem ITAM Motif an der Induktion von ROS beteiligt ist. Ein siRNA-basierendes knock-down-Experiment zeigt, dass das ITAM Adapter-Protein DAP12 für die ROS Produktion durch C. albicans und Zymosan mitverantwortlich ist.In this work the oxidative burst of the innate immune system in response to Candida albicans infection was investigated. The clinical spectrum of the human opportunistic pathogen C. albicans ranges from mucocutaneous infections to systemic life-threatening diseases in immunocompromised patients. One of the immediate early responses of cells of the innate immune system on encountering microbial pathogens is the production of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes. ROS play important roles in inflammatory reactions by destroying invading pathogens. However, overproduction of ROS may also cause endothelial damage, and excessive inflammation. Previous studies have shown that zymosan, a cell wall preparation of Saccharomyces cerevisiae, as well as C. albicans in the yeast form, strongly induce ROS in macrophages. The C. albicans genome harbours six superoxide dismutases (SOD1-6) involved in ROS degradation; SOD1 to SOD3 are intracellular and SOD4 to SOD6 are located in the cell wall.
This work demonstrates that co-culture of macrophages or myeloid dendritic cells with C. albicans cells lacking Sod5 leads to massive extracellular ROS accumulation in vitro. ROS accumulation was further increased in co-culture with fungal cells lacking both Sod4 and Sod5. Survival experiments show that C. albicans Sod5 and Sod4 double mutants exhibit a severe loss of viability in the presence of macrophages in vitro. The reduced viability of the mutants relative to wild type is not evident with macrophages from gp91phox-/- mice defective in the oxidative burst activity, demonstrating a ROS-dependent killing activity of macrophages targeting fungal pathogens. These data show a physiological role for cell surface SODs in detoxifying ROS, and suggest a mechanism whereby C. albicans can evade host immune surveillance in vivo.
The second part of this thesis aims to identify putative receptor(s) by which macrophages recognise C. albicans and induce the oxidative burst. The Toll-like receptor family and its MyD88 adaptor protein are not involved in ROS production due to zymosan or C. albicans stimulation. The c-type lectin receptor Dectin-1 can induce the ROS response via activation of Syk kinase with its immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)-like domain upon zymosan or heat-killed C. albicans stimulation. Furthermore, zymosan also activates extracellular signal related kinase ERK1/2 MAPK dependent on Dectin-1. In contrast, Dectin-1 is only moderately involved in activation of ROS and ERK1/2 when stimulated with live C. albicans. Interestingly, activation of Src and Syk kinases is essential to induce the ROS response by live C. albicans. This leads us to conclude that an ITAM-containing receptor or adaptor protein is involved in the recognition of live C. albicans. Using a siRNA-based knock-down assay, we found that one ITAM-containing adaptor protein, DAP12, may contribute to the ROS response upon fungal pathogens such as C. albicans
