Veränderungen im Methylierungsmuster der DNA geschehen früh in der Entwicklung von Tumoren. Zumeist sind Promoter-Regionen von Tumorsupressor-Genen und Onko-Genen betroffen, die einen Wachstumsvorteil der Krebszellen zur Folge haben. In dieser Studie wurde die Möglichkeit der Detektion dieser epigenetischen Aberrationen in zellfreier DNA aus Serum von Brustkrebspatienten untersucht, da diese potenzielle Biomarker zur minimal-invasiven Diagnostik darstellen.
Hierzu wurden unterschiedliche DNA–Isolationsverfahren und Amplifikationsmethoden zur Anreicherung methylierter DNA getestet. Mit den optimierten Methoden wurde Serum-DNA von Brustkrebspatienten mit A) malignen Neoplasmen (n=40), B) nicht invasiv wachsenden Tumoren (n=18) und C) gesunden Kontrollprobandinnen (n=24) isoliert.
Der DNA Gehalt im Serum von Brustkrebspatienten mit metastasierenden Tumoren [45,64ng/ml ± 32,31ng] war gegenüber gesunden Probanden [10,58ng/ml ± 9,71ng] signifikant erhöht (p = 0,0013; Wilcoxon-Rangsummentest).
Die methylierte DNA Fraktion der Proben wurde mit einem Restriktionsenzymen – basierten Verfahren und einer „Rolling Circle Amplifikation“ (RCA) genomweit angereichert. Nach erfolgreicher Prozessierung von 72 der 82 DNA Proben konnte ein Biomarker-Screening zur Unterscheidung der Patientengruppen durchgeführt werden. Dazu wurden 360 ausgewählte DNA Bereiche in Multiplex-PCR Reaktionen amplifiziert und die PCR-Produkte durch Hybridisierung auf einem „targeted-micro-array“ detektiert. Die Micro-Array Analyse erlaubte eine Unterscheidung zwischen den Brustkrebspatienten und den Normal Kontrollen, wobei jedoch nach kritischer Betrachtung ein experimenteller Bias welcher zu diesen Unterschieden beiträgt nicht ausgeschlossen werden kann.
In dieser Arbeit konnte somit ein Protokoll erarbeitet werden, das ein genomweites Biomarker-Screening zur Auffindung von DNA-Methylierungsmarkern für die minimal invasive Diagnostik aus geringsten Mengen zellfreier Serum DNA ermöglicht.Changes in DNA-methylation patterns are an early event in cancer development. Many promoter regions of tumor suppressor genes or oncogenes change their methylation status due to growth advantages of the cancer cell. During this study we investigated detection of these epigenetic aberrations in cell free DNA derived from serum of breast cancer patients, for elucidation of potential biomarkers for minimal invasive diagnostics.
Therefore several DNA isolation approaches and genome wide amplification methods for enrichment of methylated DNA were tested. Applying these optimized methods serum-DNA was isolated form sera of A) breast cancer patients with malign neoplasm (n=40), B) sera of patients with a non-invasive cancer phenotype (n= 18) and C) healthy normal controls (n=24). The DNA concentrations in serum of patients with a metastasizing tumor (45,64 ng/ml +/- 32,31ng) was significantly increased when compared to serum-concentrations of normal controls (10,58ng/ml +/- 9,71ng), (p = 0.0013, Wilcoxon-test).
The methylated fraction of the sample DNA was genome wide enriched, using a restriction enzyme based approach combined with a subsequent “Rolling Circle Amplification” (RCA). After successful sample preparation of 72 out of 82 DNA samples, a biomarker screening to distinguish between the patient study groups was performed. Therefore 360 selected DNA sequences were amplified within a multiplex-PCR approach and amplicons detected upon hybridization onto a target micro-array. Micro-array analyses enabled identification of marker-candidates for classification of study groups. However upon critical examination of our experimental setup, we can not exclude that some experimental bias contributes to this discrimination.
In this work a protocol was established which enables a genome wide biomarker screening for elucidation of DNA methylation markers for minimal invasive diagnostic testing using spurious amounts of cell free serum DNA
