Durch die Aktivität der zentralen Effektorkinase AKT (PKB) spielt der PI3K/AKT Singalweg eine wichtige Rolle bei der Transduktion von anti-apoptotischen Signalen in Zellteilung und Zellproliferation. Weiters besteht ein Zusammenhang zwischen der Deregulation des PI3K/AKT Signalwegs und dem Auftreten zahlreicher maligner Erkrankungen wie Brust- und Prostatakrebs und der Entstehung von Glioblastomen. Dies macht die Komponenten dieses Signaltransduktionsweges zu wichtigen therapeutischen Zielen. Die Aktivierung von AKT ist abhängig von der Kinase phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), welche AKT unter Mitwirkung von PIP3 aktiviert, und so als essentieller Hauptaktivator für AKT fungiert. PDK1 aktiviert auch weitere downstream Proteine der AGC Familie, welche eine wichtige Rolle für Metabolismus und Translation spielen. Es ist etabliert, dass PDK1 konstitutiv aktiv ist und Wachstumsfaktor- und Insulinsignaltransduktion indirekt die Fähigkeit von PDK1 beinflussen Substrate zu binden. Die Regulation von PDK1 ist jedoch nicht zur Gänze aufgeklärt. Weiters hat PDK1 im Laufe der letzten Jahre als therapeutisches Zielprotein an Popularität gewonnen und mehrere Inhibitoren befinden sich in klinischer Testphase. Erstmals wird mit der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass PDK1 monoubiquitiniert ist. Zudem sollen die Position, die Rolle und die molekularen Antagonisten dieser posttranslationalen Modifikation charakterisiert werden. Ubiquitin ist bekannt für seine Rolle in proteosomaler Degradation, jedoch können verschiedene Typen von konjugierten Ubiquitinepitopen auch Lokalisation, Aktivität und Konformation von ubiqutinierten Proteinen beeinflussen. Die Chrakaterisierung der PDK1 Monoubiquitinierung verspricht neue Einsicht in die Regulationsmechanismen von PDK1 in normalen und transformierten Zellen zu gewinnen. Weiters wird das Ubiquitinsystem zunehmend als therapeutisches Ziel betrachtet, da es auf enzymatischen Reaktionen basiert, die potentiell durch niedermolekulare Substanzen inhibiert werden können. Dies eröffnet die Möglichkeit Monoubiquitinierung als alternativen Winkel auszunutzen um den PI3K/AKT Signalweg über PDK1 zu inhibieren. Dieses Projekt versucht die Position der ubiqutinierten Aminosäure in PDK1 durch Mutagenese, Truncations, und Massenspektrometrie zu identifizieren. Obzwar die genaue Position des ubiquitinierten Aminosäurerests nicht definiert werden konnte, konnte die Monoubiquitinierungsstelle der Kinasendomäne zugeordnet werden. Zudem wurde versucht durch Experimente zu intrazellulärer Lokalisation, katalytischer Aktivität und PIP3 Bindung, die Funktion der Monoubiquitinierung zu ergründen. Den hier beschriebenen Resultaten zufolge ist auszuschließen, dass PDK1 Monoubiquitinierung PIP3 Bindung beeinflusst und dass diese keine
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Vorraussetzung für die Monoubiquitinierung von PDK1 ist. Die Position von PDK1 und seine Fähigkeit AKT zu phosphorylieren waren auch nicht von Monoubiquitinierung abhängig. Letztlich haben wir einen „Loss of function“ RNA-Interferenzscreen durchgeführt um eine PDK1 spezifische Deubiquitinase (DUB) zu identifizieren. Es wurde allerdings keine DUB gefunden. Obwohl die Charakterisierung der Monoubiquitinierung weitere Arbeit verlangen wird, haben wir die erste post-translationale Modifikation von PDK1 durch Ubiquitin beschrieben.The PI3K/AKT signaling pathway mediates anti-apoptotic signals and drives cell growth and proliferation via the activity of its central effector kinase AKT (PKB). Deregulation of the PI3K/AKT pathway has been linked to a large number of human malignancies such as glioblastoma, breast and prostate cancer, which makes its components interesting targets for therapy. Activation of AKT depends on the action of phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), which phosphorylates and activates AKT in a PIP3 dependent manner, and thus acts as an essential master activator of the pathway. PDK1 also activates other downstream targets of the AGC kinase family that drive metabolism and translation. It is established that PDK1 is constitutively active and that insulin and growth factor signaling indirectly affect PDK1's ability to bind its substrates, yet its regulation is incompletely understood. Furthermore PDK1 has gained popularity as a therapeutic target over the last years, and several inhibitors have been identified which are currently being tested in clinical trials. Here we show for the first time that PDK1 is mono-ubiquitinated and have attempted to elucidate the site, role and molecular antagonists of this post translational modification. Ubiquitination is known for its role in proteasomal degradation, but depending on the type of conjugated ubiquitin epitope, can also influence localization, activity and conformation of the ubiquitinated protein. Identifying the role of PDK1 mono-ubiquitination may give novel mechanistic insight into PDK1 regulation in normal and transformed cells. Additionally, the ubiquitin system is increasingly considered as a therapeutic target because it involves enzymatic reactions which can potentially be inhibited with low molecular compounds. This raises the possibility that mono-ubiquitination may be exploited as an alternative angle to target the PI3K/AKT pathway via PDK1 in cancer. In this project we have attempted to map the ubiquitinated lysine residue by mutagenesis, truncation experiments and mass spectrometry. We were able to map the ubiquitination site to the kinase domain, but finding the specific ubiquitinated residue will require further efforts. We have also attempted to identify the function of this post-translational modification by investigating localization, catalytic activity and PIP3 binding. We were able to exclude that PDK1 mono-ubiquitination affects PIP3 binding and that it is dependent on it. Our data also suggests that localization and PDK1’s ability to phosphorylate AKT are not affected by mono-ubiquitin. Finally an RNAi loss of function screen was performed to identify a de-ubiquitinase (DUB), but no DUB was found. Although our efforts to characterize PDK1 mono-ubiquitination will require further work, we have described the first post-translational modification of PDK1 by ubiquitin
