Transfer RNAs (tRNAs) spielen eine wichtige Rolle in der Biologie, denn sie entschlüsseln die Erbinformation von Lebewesen, indem sie die Messenger RNA (mRNA) ablesen und die korrekten Aminosäuren an den Ort der Proteinsynthese bringen und an die wachsende Polypeptidkette anhängen. Bevor tRNAs ihre funktionelle L-Form annehmen, müssen sie am 5’ und 3’ Ende geschnitten und zahlreiche Nukleotide modifiziert werden. Außerdem enthalten manche tRNAs (Vorläufer-tRNAs, prä-tRNAs) intervenierende Sequenzen, die in einem zweistufigen Spleißprozess entfernt werden. Dabei schneidet zunächst die tRNA Spleißendonuklease, bestehend aus TSEN2, TSEN15, TSEN34, TSEN 54, sowie der RNA Kinase CLP1, 5’ und 3’ des Introns, wodurch zwei tRNA-Exonhälften entstehen. Im Hefe-pathway wird das 5’ Hydroxylende des 3’ Exons von CLP1 phosphoryliert und das
2’-3’ Cyclophosphatende des 5’ Exons wird von einer Phosphodiesterase geöffnet, wodurch die nunmehrigen 5’ Phosphat- und 3’ Hydroxylenden von einer tRNA-Ligase verbunden werden können. Das verbliebene 2’ Phosphat wird von einer Phosphotransferase entfernt. Im Säugerpathway, der in Wirbeltieren bevorzugt verwendet wird, werden die Exonhälften direkt nach dem Schneiden ligiert, d.h. ohne weitere Modifikation durch CLP1. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass CLP1 nicht nur für die Exonphosphorylierung im Hefepathway zuständig ist, sondern bereits an der Schneidereaktion beteiligt ist und damit möglicherweise eine Funktion in beiden Pathways erfüllt.
Wir konnten zeigen, dass Mausfibroblasten, aus denen CLP1 entfernt wurde („CLP1 knock-out“) oder die eine mutierte Version von CLP1 besitzen, dessen Kinasefunktion durch eine Lysin-zu-Alanin Punktmutation (K127A) zerstört wurde, eine stark verminderte prä-tRNA-Endonukleaseaktivität zeigen. Ein ähnlicher Effekt wurde mit einer durch kleine interferierende RNAs (siRNAs) ausgelösten mRNA-Depletion in HeLa-Zellen erzielt. Diese Reduktion der entstehenden Exonmengen wurde mittels TSEN2-Koimmunpräzipitation funktionell auf den Spleißendonukleasekomplex eingeschränkt. Durch die Depletion von ATP aus Zellextrakten und anschließende Immunpräzipitation oder direkt an TSEN2-Immunpräzipitaten wurde ebenfalls eine reduzierte prä-tRNA-Endonukleaseaktivität erreicht, die den beschriebenen CLP1-Effekten ähnelt. Die Rückgabe von ATP zu depletierten Proben bewirkte die Wiederherstellung hoher Exonmengen.
Zur Charakterisierung des Prozessierungsdefekts wurde ein teilaufgereinigter CLP1-TSEN-Komplex durch eine Affinitätsreinigung einer mit Fusionsproteinen versehenen Version von Wildtyp- und K127A-CLP1 hergestellt. Die reduzierte prä-tRNA-Endonukleaseaktivität von K127A-CLP1 konnte bestätigt werden, wobei diese nicht auf die Abwesenheit eines oder mehrerer TSEN-Proteine zurückzuführen war, wie durch massenspektrometrische Analysen festgestellt werden konnte. Für eine effiziente prä-tRNA-Endonukleasereaktion war im verwendeten System ein β-γ-hydrolysierbares NTP nötig, was auch mit TSEN2-Immunpräzipitaten bestätigt werden konnte. Neben ATP konnte auch in Gegenwart von GTP, CTP oder UTP eine effiziente Prozessierung der prä-tRNA beobachtet werden. Durch die spezifische Inhibierung der Kinasefunktion von CLP1 im teilgereinigten Komplex durch eine synthetische Verbindung wurde ebenfalls eine reduzierte Endonukleaseaktivität beobachtet, was erneut für eine Beteiligung von CLP1 an diesem Prozess spricht.
Die Charakterisierung der CLP1 K127A-Mutante hinsichtlich ihrer Fähigkeit, ATP zu binden bzw. zu hydrolysieren, erbrachte keine eindeutigen Resultate. Weiters konnten wir bisher nicht mit Sicherheit feststellen, ob eine Destabilisierung des Komplexes oder eine strukturelle Reorganisation die reduzierte prä-tRNA-Schneideaktivität verursacht. Daten aus Glyzeringradienten-Zentrifugationsexperimenten und die Wiederherstellung der Aktivität nach ATP-Zugabe zu depletierten Immunpräzipitaten widerlegen diese Hypothese. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass im teilgereinigten CLP1 K127A-Komplex TSEN2, TSEN34 und TSEN54 in drastisch reduzierten Mengen vorliegen, was wiederum für eine strukturelle Reorganisations des Komplexes spricht. In einer Analyse der mRNA-Mengen von Wildtyp- und K127A-Mausfibroblasten mittels quantitativer Echtzeit-PCR konnte überdies keine erniedrigte Konzentration von CLP1 oder TSEN-mRNAs festgestellt werden, die diesen Effekt erklären würden.
Trotz der bereits erbrachten Erkenntnisse verbleiben noch zahlreiche offene Fragen bezüglich der reduzierten prä-tRNA-Endonukleaseaktivität. Einerseits muss geklärt werden, ob der Grund dafür tatsächlich in einer strukturellen Veränderung des Komplexes liegt, und falls nicht, muss die wirkliche Ursache gefunden werden. Andererseits könnte man Untersuchungen darüber anstellen, inwiefern CLP1 auch Proteinkinaseaktivität besitzt und dies die Exonentstehung beeinflussen könnte. Schließlich konnten wir auch Hinweise für eine Phosphorylierung der TSEN-Proteine finden, die den Ausgangspunkt eines völlig neuen Forschungsprojekts darstellen könnte.Transfer RNAs (tRNAs) play a fundamental role in biology. They decode the messenger RNA (mRNA) and carry amino acids to the sites of protein synthesis. Before they can adopt their mature, L-shaped conformation, they have to undergo numerous processing steps such as 5’ and 3’ end trimming and nucleotide modifications. A subset of vertebrate tRNAs is also transcribed as intron-containing precursor molecules (pre-tRNAs). The intervening sequence of this tRNA subset needs to be removed by a two-step splicing process. First, the tRNA splicing endonuclease (TSEN) complex, consisting of TSEN2, TSEN15, TSEN34, TSEN54, and the RNA kinase CLP1, cleaves the pre-tRNA at the 5‘ and 3‘ ends of the intron. This cleavage generates 5‘ and a 3‘ tRNA exon halves. In the yeast-like ligation pathway in human cells, the 5‘ hydroxyl terminus of the 3‘ exon is subsequently phosphorylated by CLP1, and the 2‘-3‘ cyclic phosphate at the 3’ end of the 5‘ exon is a substrate for a cyclic phosphodiesterase, allowing for a canonical 5' phosphate 3' hydroxyl ligation by a still elusive tRNA ligase. The remaining endogenous 2‘ phosphate is removed by a 2‘ phospho-transferase. In the animal pathway, which is predominantly used in vertebrates, the exon halves are directly ligated. Thus, CLP1 is dispensable for this type of ligation reaction. From the data presented in this work, we hypothesize that CLP1 not only performs phosphorylation of the 3’ exon half, but that ATP hydrolysis by CLP1 is additionally required for the preceding step, the generation of the exon halves by the TSEN complex. Therefore, CLP1 might be relevant for both tRNA splicing pathways.
We show that extracts prepared from mouse embryonic fibroblasts (MEFs) that are devoid of CLP1 (“CLP1 knock-out”) or harbor a lysine-to-alanine point mutation (K127A) in CLP1 rendering the kinase inactive (“kinase-dead”) exhibit largely reduced pre-tRNA cleavage. In support of these data, knocking down CLP1 in HeLa cells by small interfering RNAs (siRNAs) resulted in a similar reduction in exon generation by the TSEN complex. The deficiency in pre-tRNA cleavage could be confirmed with TSEN2-immunoprecipitates from kinase-dead MEFs, pinpointing the defect to the pre-tRNA splicing endonuclease complex.
When we removed ATP from TSEN2-immunoprecipitates from HeLa cells or performed co-immunoprecipitations with extracts depleted of ATP, we detected reduced tRNA exon generation, mimicking the effects previously observed upon interfering with CLP1’s kinase function. Interestingly, adding back ATP to the depleted immunoprecipitates restored pre-tRNA cleavage.
In order to further elucidate the pre-tRNA cleavage deficiency phenotype, we used a semi-purified CLP1-TSEN complex obtained by a one-step purification of a tagged version of wild type and K127A CLP1. In addition to reduced exon generation with the mutant CLP1 complex, we found that the wild type complex requires a β-γ-hydrolyzable NTP for efficient pre-tRNA cleavage, confirming results obtained with TSEN2-immunoprecipitates. Mass spectrometry analysis of the semi-purified complexes confirmed the presence of the TSEN proteins in both CLP1 wild type and K127A samples. Furthermore, we found that GTP, CTP, and UTP could efficiently replace ATP in pre-tRNA cleavage. Additional evidence for CLP1’s role in pre-tRNA cleavage came when we added a specific CLP1 inhibitor to the semi-purified complex and subsequently observed reduced exon generation.
However, the characterization of the CLP1 K127A mutant, regarding its ATP binding or hydrolysis competence, did not yield clear results. Moreover, we could not yet determine definitely if the disassembly of the complex or a structural rearrangement cause the cleavage deficiency. Data from glycerol gradient centrifugations and the results from addition of ATP to depleted immunoprecipitates argue against complex disassembly. In contrast, we found that in the CLP1 K127A semi-purified complex the levels of TSEN2, TSEN34, and TSEN54 were largely diminished, favoring the idea of complex destabilization. Quantitative real-time PCR results obtained by comparing wild type and kinase-dead MEFs disproved the hypothesis that the cleavage deficiency is caused by reduced TSEN or CLP1 mRNA levels.
There remain several areas for further research on this topic. On the one hand, the reason for deficiency in pre-tRNA cleavage needs to be elucidated and the potential complex rearrangement must be clarified. On the other hand we could further investigate a putative protein kinase function of CLP1 and try to determine the biological role of a possible TSEN phosphorylation detected in the semi-purified endonuclease complex. For these two issues we could obtain only preliminary data so far; thus, they could be the starting point for new research projects
