Bei einer viralen oder bakteriellen Infektion, ist ein gut funktionierendes Immunsystem überlebenswichtig für den menschlichen Organismus. Ein gutes Verständnis für das Zusammenspiel der Bestandteile des Immunsystems ist daher entscheidend. Verschiedene Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkennen bestimmte molekulare Muster an Krankheitserregern, woraufhin eine große Anzahl von Proteinen an der Signalübertragung beteiligt ist und eine vermehrte Aktivierung antimikrobieller Gene hervorruft.
TBK1 (TANK-binding kinase 1) und IKKi (IkappaB kinase-I) sind zwei verwandte Serin/Threonin Kinasen und spielen eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung im angeborenen Immunsystem. Nach bakterieller oder viraler Infektion aktivieren die beiden die Transkriptionsfaktoren IRF3/7 und NF-kappaB. Es wurde nachgewiesen, dass TBK1 und IKKi mit drei Bindungsproteinen, TBKBP1, TBKBP2 (TBK binding proteins 1 and 2) und TANK (TRAF family member associated NF-kappaB activator) interagieren (Bouwmeester, Bauch et al. 2004). Der Mechanismus zur Aktivierung von TBK1 und IKKi, und die Rolle der Bindungsproteine in diesem Prozess sind jedoch noch nicht vollkommen geklärt.
Das Hauptaugenmerk dieser Studie lag auf der Untersuchung der molekularen Architektur des Komplexes und der Bedeutung der Bindungsproteine bezüglich der Aktivität von TBK1 und IKKi. Um das zu untersuchen führten wir eine systematische TAP Analyse von den am Komplex beteiligten Komponenten, den beiden Kinasen TBK1 und IKKi und den Bindungsproteinen TBKBP1, TBKBP2 und TANK, durch .Obwohl wir die Interaktion zwischen den Bindungsproteinen und TBK1 und IKKi bestätigen konnten, haben wir festgestellt dass die Bindungsproteine selbst nicht aneinander binden. Dieses Ergebnis lässt vermuten dass TBK1 und IKKi wahrscheinlich unabhängige Komplexe mit den verschiedenen Bindungsproteinen formen.
Die Verwendung von verschiedenen TBK1 Mutanten und Immunoprezipitationsexperimente haben gezeigt, dass alle drei Bindungsproteine an dieselbe Region in TBK1, die so genannte coled coil 2 Region, binden.
Nach Analyse dieser Region konnten wir 2 Aminosäuren (M690 und E696) finden, welche wichtig für die Bindung der drei Bindungsproteine and TBK1/IKKi sind, da Mutationen in diesen Aminosäuren die Bindung von TBK1 an die 3 Bindungsproteine verhindern. Zusätzlich haben wir eine Aminosäure (an Position L693) entdeckt, die speziell die Bindung von TANK an TBK1/IKKi verhindert, ohne die Bindung von TBKBP1 und TBKBP2 an TBK1 zu beeinträchtigen. Das bedeutet dass die drei Bindungsproteine in der gleichen Region von TBK1 binden, allerdings die Interaktion von einzelnen verschiedenen Aminosäuren abhängt.
In unseren Überexpressionsexperimenten konnten wir außerdem sehen, dass die Aktivität von TBK1/IKKi nicht unbedingt mit der Bindung an die drei Bindungsproteine korreliert. Diese Daten sind ein Indikator dafür, dass die Bindungsproteine verschiedene Subkomplexe formen, welche sich in ihrer Funktion nicht ersetzen lassen.The proper functioning of the immune system is crucial for a human organism to defend against viral and bacterial infections. Consequently, it is extremely important to understand the complex interplay between molecules of the immune system. Upon infection, several human receptor types recognize conserved molecular patterns that are a feature of pathogens. A large number of proteins then participate in downstream signaling, resulting in expression of antimicrobial genes.
TBK1 (TANK-binding kinase 1) and IKKi (IkappaB kinase-I) are two related serine/threonine kinases that play an important role in innate immunity signaling. Upon bacterial and viral infection, TBK1 and IKKi activate the transcription factors IRF3/7 and NF-kappaB. TBK1 and IKKi have been found to interact with three adaptors: TBKBP1, TBKBP2 (TBK binding proteins 1 and 2) and TANK (TRAF family member associated NF-kappaB activator) (Bouwmeester, Bauch et al. 2004). Yet, the mechanism of TBK1 and IKKi activation and, correspondingly, the role of these proteins are still not fully understood.
The main focus of this study was to investigate the molecular architecture of this complex and to elucidate the role of the proteins concerning TBK1 activity. In order to achieve this we first performed a systematic TAP analysis of all the different components of the complex: the two kinases (TBK1 and IKKi) and the three adaptor proteins (TBKBP1, TBKBP2 and TANK). Even though we confirmed the interaction of the adaptor proteins to TBK1 and IKKi we didn’t find any of the binding proteins interacting with each other, suggesting that TBK1 and IKKi are most likely forming independent sub-complexes with each of the adaptors.
In agreements with this hypothesis, immunoprecipitation experiments suggested that all three adaptor proteins bind to the same region of TBK1 (coiled coil 2). After analyzing the coiled coil 2 structure, we were able to identify single amino acids responsible for the interaction. Amino acids at the position M690 and E696 in TBK1 were important for its binding to all the adaptor proteins because mutation of these residues abolished binding to all of the TBK1 adaptors. On the other hand, mutation of L693 selectively abrogated binding of TANK without affecting binding of TBKBP1 or TBKBP2, indicating that the adaptor proteins bind to the same region but make contacts with different amino acids.
Additionally we found that upon overexpression conditions, TBK1 activity was independently of binding to the adaptor proteins. Altogether, these data suggest that each TBK1 adaptor forms a distinct sub-complex that is required for non-redundant functions of TBK1
