Der Zellzyklus stellt einen praezise kontrollierten Ablauf von Ereignissen dar, welche in der Erzeugung von zwei identischen Tochterzellen gipfeln. Um eine ordnungsgemaeße Abfolge der notwendigen Ereignisse zu ermoeglichen produziert die Zelle regulatorische Protein, welche an bestimmten Kontrollpunkten das Fortschreiten des Zellzyklus verhinden. Sind alle Voraussetzungen fuer das Fortsetzen des Zellzyklus erfuellt, werden Polyubiquitinketten an die inhibitorischen Zellzyklusproteine geheftet, wodurch diese fuer die proteasomabhaengige Degradation freigeben werden.
Der Anaphase-einleitende Komplex (APC/C) ist ein 1,5 MDa grosser Proteinkomplex bestehend aus ueber 12 unterscheidlichen Proteinuntereinheiten. Am Ende der Metaphase katalysiert der APC/C die Anheftung von Ubiquitinmolekuelketten an die zwei Zellzyklusregulatoren Secruin und CyclinB. Deren Degradation fuehrt zum Uebergang in die Anaphase, in der die zwei Schwesterchromatide auf die zukuenftigen Tochterzellen aufgeteilt werden. Um eine einwandfreie Aufteilung zu ermoeglichen, muss zuerst eine bidirektionale Anheftung beider Schwesterchromatide an den Spindelapparat sichergestellt sein, bevor der APC/C akitviert werden kann. Solange diese bidirektionale Orientierung nicht gewaehrleistet ist, wird der APC/C durch den Spindelassemblierungs-Kontrollpunkt (SAC) in seiner Funktion gehemmt.
Manche Zellzyklusregulatoren enthalten bestimmte Sequenzmotife, sogenannte Degradationsmotife, welche diese Proteine als Substrate fuer die APC/C-abhaengige Ployubiquitinierungsreaktion kennzeichnen. Die gelaeufigsten Degradationsmotife sind die D-Box und die KEN-Box. Die Rekrutierung dieser Substrate an den APC/C sowie dessen katalytische Aktivierung wird durch sogenannte Koaktivatorproteine, Cdc20 oder Cdh1, sichergestellt. Diese Koaktivatoren besitzen eine WD40 Domaene, welche auch als Protein-Protein-Interaktionsdomaene bekannt ist. Ausserdem sind die C-Box im N-terminus sowie das C-terminale IR-Ende eine wichtige Voraussetzung fuer eine funktionelle Interaktion der Koaktivatoren mit dem APC/C.
Mittels Koexpressionsstudien in Hefe- und Insektenzellen konnte gezeigt werden, dass APC/C-Modellsubstrate spezifisch an die WD40 Domaene von Cdh1 binden. Durch zahlreiche in vitro Experimente konnte weiterhin gezeitg werden, dass die C-Box eine wichtige Voraussetzung fuer eine effiziente Rekrutierung dieser Cdh1-Substrat-Komplexe an den APC/C darstellt. Cdh1 C-Box Mutanten haben ausserdem negative Auswirkung auf in vitro Ubiquitinierungsreaktionen im Vergleich zu wildtyp Cdh1. Ergebnisse aus elektronenmikroskopischen Aufnhamen unterschiedlicher APC/C-Komplexe und anschließender 3D Modellierung weisen darauf hin, dass sich die Bindestelle des mitotisches Kontrollkomplexes (MCC) am APC/C teilweise mit der der Koaktivatoren ueberschneidet. MCC-gebundener APC/C ist stark inhibiert in seiner Faehigkeit, Substrate in vitro zu binden. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass der mitotische Kontrollomplex die Substratbindestelle am APC/C physikalisch blockiert.The cell cycle is a highly ordered and coordinated sequence of events which results in two daughter cells emerging from one mother cell. To properly carry out the cell cycle program the cell produces regulatory proteins that inhibit the progression to the next stage if they are not destroyed. The degradation of mitotic regulators depends on the ubiquitin-proteasome system.
The Anaphase Promoting Complex/ Cyclosome (APC/C) is a 1.5 MDa ubiquitin ligase complex composed of at least a dozen subunits. The APC/C ubiquitylates its specific substrates with the help of the activator proteins, Cdc20 and Cdh1, and thereby targets substrates for proteasomal destruction. Strict regulation of APC/C activity is essential for faithful chromosome segregation and timely mitotic exit. The most prominent mechanism of APC/C control at the metaphase-to-anaphase transition is the spindle assembly checkpoint (SAC). The SAC inhibits APC/C until every single chromatid pair has been attached to the mitotic spindle and bi-oriented.
The aim of this project was to understand how substrates are recruited to APC/C and if substrate recruitment is controlled by the spindle assembly checkpoint (SAC).
All APC/C substrates contain one or more degradation motifs, the most common are the D-box and the KEN box, which specifically target them to the APC/C and its activator proteins. Substrate recruitment to the APC/C, as well as activation of the APC/C in the ubiquitylation reaction, depends on activators, Cdc20 and Cdh1. APC/C activators contain several conserved motifs, the most prominent one is the WD40 propeller domain, present in a variety of proteins and implicated in protein-protein interactions. By co-expression experiments in yeast and insect cells I could show that a WD40 domain of Cdh1 is sufficient to bind an APC/C substrate in a D box and KEN box dependent manner.
Anchoring of activators to the APC/C is mediated by their carboxy-terminal IR tail. Efficient binding of activators to APC/C also depends on another conserved activator sequence, called the C-box. Through a set of in vitro protein binding experiments I could show that the C-box is, in addition, also necessary to recruit substrates efficiently to APC/C-activator complexes. I could further show that restoring APC/C binding to wild type levels did not restore the activator function of C-box mutant Cdh1 in an in vitro ubiquitylation reaction.
To understand how the SAC inhibits the APC/C we used single-particle electron microscopy to obtain three dimensional models of human APC/C in various functional states: bound to a Mitotic Checkpoint Complex (MCC), to Cdc20, or to neither (apo-APC/C). These experiments revealed that the MCC binding site on APC/C partially overlaps with Cdc20 binding site, which suggested that the MCC might physically prevent substrate binding to the APC/C. To test this prediction I performed in vitro substrate binding assays which showed that substrate binding to APC/CMCC is strongly reduced
