Genexpressionsmuster sind einer ständigen Veränderung unterworfen, einerseits aufgrund von Stresssituation, andererseits aber auch als Teil des normalen Entwicklungszyklus. Eine schnelle Änderung der Aktivität eines Transkriptionsfaktors (TF) ist notwendig, um schnelle Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen oder Zustände in der Zelle zu ermöglichen. Ein Mechanismus um die Aktivität schnell anzupassen ist Phosphorylierung. Sie kann Einfluss auf die Lokalisierung, Stabilität, DNA Bindung oder Protein-Protein Interaktion des TF haben. BZIP (basic leucine zipper) TF sind an der Regulation diverser Prozesse beteiligt und wurden in allen Eukaryoten gefunden. Das Genom von Arabidopsis thaliana codiert für ca. 75 davon. C/S1 Gruppen Mitglieder könnten eine Rolle bei der Regulation der Genexpression als Reaktion auf Energie Mangel und Stress aber auch in der Samenreifung spielen. Im Zusammenhang mit Energie Mangel wurden sie bereits mit AKIN10 und AKIN11 in Verbindung gebracht, 2 Kinasen für die eine zentrale Rolle in der Energie-Mangel-Signaltransduktion vorgeschlagen wird. Das legt nahe, dass Phosphorylierung eine Rolle für die Aktivität des TF spielt.
Hier zeige ich, dass bZIP63, ein Mitglied der C-Gruppe, in planta phosphoryliert ist. Dafür wurden bZIP63-GFP Überexpressor Pflanzen in zwei unterschiedlichen Ansätzen verwendet: 2D gel Elektrophorese in Kombination mit Western blots und Immunpräzipitation gefolgt von Massenspektrometrie (MS) Analyse. Auf Western blots von Protein Extrakten nach 2D Elektrophorese kann man einen Shift des Signals von bZIP63-GFP zum höheren pH Bereich beobachten, was auf in vivo Phosphorylierung hindeutet. Immunpräzipitation und MS Analyse von bZIP63-GFP aus im Dunklen geernteten Blättern führte zur Identifikation von 4 in vivo Phosphorylierungsstellen auf dem Protein unter diesen Bedingungen. In-Gel Kinase Assays wurden verwendet um potentielle bZIP63 spezifische Kinasen zu identifizieren. Es gab 3 starke Signale, was auf Beteiligung von mindestens 3 Kinasen hinweist. Zur Identifikation der Kinasen wurden Proteine mit einer hohen Affinität zu bZIP63 durch Affinitätsreinigung im Proteinextrakte angereichert, bevor dieser in In-Gel Kinase Assays verwendet wurde. Im Bereich des Signals wurden Gelstücke ausgeschnitten und darin enthaltene Proteine durch MS identifiziert. 3 Gruppen von Kinasen wurden gefunden. 2 Mitglieder der SnRK1 Familie, AKIN10 und AKIN11, wurden identifiziert. CDPKs (calcium dependent protein kinases) waren mit CPK3 und einigen anderen Mitgliedern vertreten, die jedoch aufgrund schlechter Proteinabdeckung nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Die dritte Gruppe von Kinasen ist Casein Kinase II, von der 2 katalytische Untereinheiten, CKA1 und CKA2, gefunden wurden. Zusammengefasst war es mir möglich mehrere in vivo Phosphorylierungsstellen und potentielle bZIP63 spezifische Kinasen zu identifizieren und die Basis für weitere Untersuchungen über die Funktion der Phosphorylierung zu legen.Gene expression patterns change constantly in response to stress, but also as part of the normal developmental cycle. Rapid change in the activity of a TF (transcription factor) is essential to allow fast responses to changing environmental or intracellular conditions. One mechanism to modulate TF activity rapidly is phosphorylation, which can affect localisation, stability, DNA binding or protein–protein interaction of the TF. BZIP (basic leucine zipper) transcription factors are involved in regulation of numerous processes and can be found in all eukaryotes. The Arabidopsis thaliana genome encodes about 75 of them. The C/S1 group members are proposed to play a role in reprogramming gene expression in response to energy deprivation and stress as well as in seed maturation. In the context of energy deprivation they were already associated with AKIN10 and AKIN11, 2 kinases proposed to be central regulators of energy deprivation signalling. This suggested a role for protein phosphorylation in the activity of these transcription factors.
Here I show that bZIP63, a member of the C–group, is phosphorylated in planta using bZIP63–GFP over–expressor plants in two different approaches: 2D gel electrophoresis in combination with Western blotting and Immunprecipitation followed by Mass spectrometry analysis. On Western blots of protein extracts after 2D separation the signal from bZIP63–GFP shifts to higher pH ranges when the extract is treated with phosphatase, indicating in vivo phosphorylation of the protein. Immunprecipitation and Mass spectrometry analysis of bZIP63–GFP from leaves collected in the dark revealed 4 in vivo phosphorylation sites on the protein under these conditions. In–gel kinase assays were used to identify potential bZIP63 specific kinases. 3 strong signals were obtained from total protein extracts, indicating a role for at least 3 kinases. For identification of the kinases protein extracts were enriched for proteins with a high affinity for bZIP63 via affinity purification before use in the in–gel kinase assay. Gel slices were cut out in the range of the signal and proteins identified by Mass spectrometry. 3 groups of protein kinases were found in the samples. Two members of the SnRK1 (SNF1 (Sucrose non–fermenting1) related kinases) family, AKIN10 and AKIN11 were identified. CDPKs (calcium dependent protein kinases) were represented by CPK3 and some other members, but protein coverage for these was too low for clear identification. The third group of kinases is Casein Kinase II, of which two catalytic subunits, CKA1 and CKA2 were found. Taken together, I could identify several in vivo phosphorylation sites on bZIP63 and potential bZIP63 specific kinases clearing the way for further investigation on function of bZIP63 phosphorylation
