Der Zellkern, das charakteristische Merkmal eukaryotischer Zellen, wird von einer Kernhülle eingeschlossen, die aus einer doppelten Lipidmembran mit eingefügten Kernporenkomplexen und einer filamentösen Kernlamina in mehrzelligen Arten, die der inneren Kernmembran anliegt, besteht. Mehrere integrierte innere Kernmembranenproteine enthalten ein spezifisches Strukturmotiv, die sogenannte LEM-Domäne (LAP2, Emerin, MAN1), die das DNA-bindende Molekül BAF (barrier-to-autointegration factor) bindet. Mutationen in LEM Proteinen wurden mit humanen Pathologien assoziiert, die in der heterogenen Gruppe der sogenannten "Envelopathien" zusammengefaßt werden. Zwei neue LEM Proteine, LEM2 und LEM3, wurden in der vorliegenden Dissertation identifiziert und analysiert.
LEM2 ist ubiquitär in Geweben und Zelltypen exprimiert und ist sowohl bezüglich der Primärsequenz als auch der Domänen-Topologie eng mit MAN1 verwandt. Komplementations-assays zeigten, daß Funktionen von LEM2 von der Hefe bis zum Menschen konserviert sind. In Säugetierzellen lokalisiert LEM2 an der inneren Kernhülle, interagiert direkt mit Lamin A/C und BAF und benötigt A-typ Lamine für die Lokalisation an der Kernmembran. Die Lamin A/C-interagierende Region wurde auf einen Teil des N-Terminus eingegrenzt, wohingegen der C Terminus ein DNA-Bindungsmotif enthält. Letzteres ist essentiell für überexprimierte LEM2-Fragmente um Komplexe an der Kernhülle zu formen, die Lamin A und Lamin A-assoziierte Proteine rekrutieren können, jedoch Lamin B und Lamin B-assoziierte Protein exkludieren. Unsere bisherigen Daten weisen auf eine Rolle von LEM2 in der räumlichen Organisation von Komplexen an der Kernhülle und in der Chromatinorganisation an der Kernperipherie hin.
LEM3 wurde vor allem in hämatopoietischen Geweben gefunden, so etwa im Knochenmark, Thymus und Milz, sowie in Lymphoma. Eine Analyse der LEM3 Domänenstruktur zeigte eine Gruppe von Ankyrin-Repeats am N-terminus des Proteins sowie ein evolutionär konserviertes GIY-YIG Motif innerhalb des C-Terminus welches zuvor in verschiedenen Proteinen mit Nukleasefunktion beschrieben wurde. Desweiteren habe ich zwei LEM3 Splice-Isoformen identifiziert bei welchen Teile der LEM Domäne fehlen, wobei diese im Gegensatz zum vollständigen LEM3 BAF nicht binden können. LEM3 enthält keine Transmembran-Regionen und wurde als Kern/Zytoplasma-"Shuttling"-Protein identifiziert. In menschlichen Zellen kolokalisiert LEM3 mit cytoplasmatischen Aktin-Filamenten, während es nach pharmakologischer Inhibierung des Kernexports in nukleären "Splicing-Speckles" zu finden ist. Ektopische Expression von LEM3 führte zu einer Mislokalisation von BAF, Zellzyklusarrest und Aktivierung des ATM abhängigen DNA-Schädigungs-Signalweges. Wir postulieren eine Funktion von LEM3 in der DNA Rekombination oder im DNA Reparatur Signalweg.The nucleus in eukaryotic cells is enclosed by a nuclear envelope consisting of an inner and outer membrane, nuclear pore complexes, and in metazoans a filamentous lamina meshwork underlying the inner nuclear membrane. The lamina consists of intermediate filament-type proteins, the lamins, and numerous integral inner nuclear membrane proteins. Among these, a family of membrane proteins contain a conserved structural motif, called LEM domain (LAP2, Emerin, MAN1), which interacts with the DNA binding molecule BAF (barrier-to-autointegration factor). LEM proteins have been implicated in chromatin organization and gene expression control and have been linked to a heterogeneous group of inherited human diseases, collectively termed "envelopathies". This PhD thesis describes the identification and initial characterization of two novel LEM proteins, LEM2 and LEM3.
LEM2 is ubiquitously expressed in many tissues and cell types and is closely related to MAN1 in primary sequence and domain topology. Complementation assays revealed that LEM2 is functionally conserved from yeast to man. In mammalian cells, it localizes at the inner nuclear membrane, interacts directly with A-type lamins and with BAF, and requires lamin A/C for nuclear envelope localization. The lamin A/C interaction domain was mapped to the N-terminus, while the C-terminus contains a conserved DNA binding motif. The latter was required for the ability of overexpressed LEM2 fragments to form patches at the nuclear envelope that recruit lamin A and lamin A-binding proteins, but exclude lamin B and associated proteins. Our data suggest a role of LEM2 in the spatial organization of protein complexes at the nuclear envelope and in chromatin organization at the nuclear periphery.
LEM3 is primarily expressed in hematopoietic tissues such as bone marrow, thymus and spleen, and in lymphoma-derived cell lines, suggesting a B-cell related function. Analysis of LEM3 domain topology revealed a cluster of Ankyrin repeats at the N-terminus and a conserved C terminal GIY-YIG motif previously described in proteins with nuclease activity. I identified two LEM3 splice-isoforms lacking parts of the LEM domain. Unlike these isoforms full length LEM3 bound BAF. LEM3 misses a transmembrane domain and was found to shuttle between nucleoplasm and cytoplasm. In human cells ectopic LEM3 co-localizes with cytoplasmic actin filaments, while it is in nuclear splicing speckles upon pharmacological inhibition of nuclear export. Ectopic expression of LEM3 in the nucleus causes a mislocalization of BAF, cell cycle arrest, and activation of the ATM-dependent DNA damage pathway. We propose that LEM3 may be involved in DNA recombination or repair pathways
