Strukturelle und biochemische Charakterisierung des cytosolischen C-Terminus von Polycystin-2 und seine Interaktion mit dem Zytoskelett-assoziierten Protein mammalian diaphanous homolog 1

Abstract

Das PKD2 Gen ist eines der beiden mutierten Gene in Patienten, die an Autosomal-dominanter polyzystischer Nierenerkrankung leiden. Es kodiert für das Protein Polycystin-2, das aus 968 Aminosäuren besteht und aus sechs Transmembrandomänen und cytosolische N- und C-Termini aufgebaut ist. Für den cytosolischen C-Terminus wurden verschiedene Strukturmerkmale vorhergesagt und es ist eine Vielzahl an Interaktionspartnern, mit unterschiedlichsten Funktionen in der Zelle, bekannt. Ziel dieser Arbeit war es nun, mithilfe unterschiedlicher spektroskopischer Methoden detailliertere strukturelle und biochemische Informationen über den cytosolischen C-Terminus zu erhalten. Dafür wurden neben dem gesamten cytosolischen C-Terminus unterschiedliche Fragmente, die ein oder mehrere der Strukturmerkmale besitzen, einer strukturellen und biochemischen Analyse unterzogen. Weiterhin wurde die Interaktion mit dem Zytoskelett-assoziierte Protein mDia1 untersucht. Für das Fragment PKD2C680-796 wurde bereits die NMR-Struktur am Lehrstuhl gelöst und die Existenz von zwei EF-Händen bewiesen. Innerhalb dieser Arbeit erfolgte die Zuordnung der Ringprotonen der Aromaten über 2D-(1H-1H)-TOCSY und –NOESY-Spektren für Tyr684, Tyr762, Phe738, Phe759, His709, His750, His773, His775 und His793. Weiterhin konnte über die Spektren die Existenz verschiedener Zustände aufgrund partieller Ca2+-Beladung gezeigt werden. Daraus konnte abgeleitet werden, dass die Sättigung beider EF-Hände mit Ca2+ für das Vorhanden sein einer wohldefinierten Struktur von großer Bedeutung ist. Diffusionsmessungen zeigen bei Bindung von Ca2+ eine Monomerisierung. Für die vier Histidine His750, His773, His775 und His793 wurden mittels pH-Titrationen die pK-Werte bestimmt. Die pK-Werte von His773 und His775 sind durch die direkte Nähe zum Ca2+ in den EF-Händen, stark von der Beladung mit Ca2+ der EF-Hände beeinflusst und zeigen deutlich erniedrigte pK-Werte im Vergleich zum Durchschnitt für Histidine in Proteinen. Die CD-spektroskopische Analyse zeigt bei vollständiger Beladung mit Ca2+ eine überwiegend alpha-helikale-Struktur aber auch einen hohen ungeordneten Anteil. Bei der Hochdruck-NMR-spektroskopischen Untersuchung fanden sich für das partiell mit Ca2+-beladene PKD2C680-796 erneut Hinweise für das Vorliegen verschiedener Zustände. Bei Anwendung von Druck zeigte sich für die an der Ca2+-Bindung beteiligten Aminosäure starke Änderungen. In Abwesenheit von Ca2+ zeigten sich nur noch kleine druckbedingte Shifts. Die Vermutung liegt nahe, dass das Ca2+ durch Anwendung von Druck freigesetzt wird. Bei Betrachtung der EF-Hand-Mutanten konnte gezeigt werden, das bei Mutation der EF-Hand 1 immer noch die Bindung von Ca2+ an die EF-Hand 2 möglich ist (KD-Wert = 86 µM). Umgekehrt ist dies nicht der Fall. Der strukturelle Einfluss durch Mutationen an EF-Hand 1 im Vergleich zur EF-Hand 2 hingegen ist deutlich größer. Es konnte gezeigt werden, dass für die wohldefinierte Faltung des Proteinfragments beide (funktionierende) EF-Hände und deren Beladung mit Ca2+ wichtig sind. Für das Fragment PKD2C680-796 konnte gezeigt werden, dass es anders als vermutet, von dem Zytoskelett-assoziierten mDia1(69-457) im Bereich der Ca2+-beladenen EF-Hände mit einem KD-Wert = 39 µM gebunden wird und von diesem wie eine Klammer umschlossen wird. Auch hier ist das Vorhandensein beider EF-Hände für die Bindung erforderlich. Für das Fragment PKD2C725-880 wurden bei Ca2+-Zugabe die gleichen Veränderungen in den 1D-1H-Spektren und CD-Spektren wie auch im Fragment PKD2C680-796 gefunden. Im Bereich der EF-Hände und des Linkers dazwischen, sowie im Bereich des ER-Retentionssignals erfolgte eine Zuordnung der Resonanzen im 2D-(1H-15N)-HSQC. Mittels Diffusionsmessungen konnte gezeigt werden, dass PKD2C725-880 in Lösung als heterogenes Gemisch aus hohen Aggregaten und Dimer/Monomer (abhängig von der Ca2+-Beladung) vorliegt. Nach Abtrennung der Aggregate über eine Gelfiltrationssäule, kann das gleiche Monomer-/Dimer-Gleichgewicht, wie auch schon für PKD2C680-796, gezeigt werden Für den gesamten cytosolischen C-Terminus PKD2C680-968 traten die identischen Veränderungen bei Ca2+-Zugabe auf, wie schon für PKD2C680-796 und 725-880. Auch in den Diffusionsmessungen zeigte sich erneut das Monomer-/Dimer-Gleichgewicht. Im Bereich des ER-Retentionssignals wurde in Abwesenheit von Ca2+ eine starke Reaktion auf pH-Änderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen gefunden. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegend alpha-helikalen-Anteil. Für das Fragment PKD2C797-968 wurde gezeigt, dass es in Lösung als heterogenes Gemisch vorliegt und im Bereich des ER-Retentionssignals wurde auch hier eine Sensitivität auf pH-Veränderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen gefunden. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegend alpha-helikalen-Anteil. Das nach Trypsinverdau erhaltene Fragment PKD2C828-900 liegt in Lösung als heterogenes Gemisch vor. Es zeigt keine Reaktionen auf Ca2+ und eine hohe Beweglichkeit am Ende der Coiled-Coil-Domäne. Die CD-Spektren zeigen einen überwiegendalpha-helikalen-Anteil. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle Fragmente, die die EF-Hände beinhalten, gleiche Veränderungen in den Spektren und ein Dimer-/Monomer-Gleichgewicht bei Ca2+-Zugabe zeigen. Alle Fragmente, die die Coiled-Coil-Domäne der Kristallstruktur beinhalten, zeigen in Lösung ein heterogenes Verhalten und zeigen Aggregation. Der Bereich des ER-Retentionssignals zeigt eine Sensitivität für pH-Änderungen oder die Anwesenheit von bivalenten Kationen