Die grüne Kugelalge Volvox carteri zählt mit nur zwei Zelltypen � somatischen und reproduktiven � zu den einfachsten Modellorganismen für das Studium der Zelldifferenzierung. Diese Differenzierung wird von drei Genloci � gls, lag und regA � gesteuert. In dieser Arbeit steht das regA-Gen im Vordergrund der Untersuchungen. Seine Transkription und Expression bestimmen den zellspezifischen und den zeitlichen Verlauf der Differenzierung. Die regulatorische Wirkung des RegA-Proteins und die Regulation des regA-Gens selbst sind die entscheidenden Aspekte der Differenzierung von somatischen Zellen.
Untersuchungen in dieser Arbeit zielten darauf ab, erstens die von RegA ausgeübte Genkontrolle und zweitens die Regulation der Translation des regA-Gens selbst besser zu verstehen. Mit diesen Vorgaben wurden (1) das TATA-Box-Bindeprotein (TBP) von V. carteri charakterisiert und rekombinant exprimiert, (2) ausführliche Versuche zur heterologen Expression und Reinigung von RegA und spezifischen Antiseren unternommen und (3) Kontrollelemente der Translation in der 5�NTR von regA identifiziert.
1. Das tbp-Gen wurde aus V. carteri isoliert und rekombinant exprimiert. Das single-copy Gen enthält sechs Exons und fünf Introns und kodiert für ein Protein mit 340 AS-Resten. Ein Vergleich mit bekannten TBP-Proteinen zeigte, daß die Kernregion hochkonserviert ist. Als Novum gegenüber tierischen und pflanzlichen TBPs trägt es eine 120 AS-Reste lange C-terminale Domäne mit prominenten Glutamin-, Alanin- und Prolin-Clustern, die auf eine regulatorische Funktion (ähnlich den N-terminalen Domänen tierischer TBPs) hindeuten. Die heterologe Expression von tbp cDNA im E. coli-System und die Reinigung von rekombinantem TBP verlief problemlos.
2. Im E. coli-System gelang die Expression eines 393 AS-Reste langen N-terminalen Fragments des RegA-Proteins. Ferner wurden mit dem Baculovirus-Insektenzell-System geringe Mengen von RegA und eine Serie von C-terminal verkürzten Fragmenten gewonnen, die auf unvollständige Translation von regA zurückgeführt wurden. Gegen beide Proteinfraktionen wurden spezifische Antikörper hergestellt und gereinigt. Diese waren genügend empfindlich, um rekombinantes RegA und das RegA-Protein in Überexpressions-Stämmen, nicht aber im WT-Volvox-Stamm, zu detektieren.
3. Das regA-Gen enthält vier nicht-kodierende Exons in der 5�NTR mit acht ATG-Tripletts. Die Bedeutung der ATG-Tripletts für die Translation des regA-Transkripts wurde mittels Komplementation mit ATG nach TGG-Mutationen in einem Volvox-Stamm, der ein defektes regA-Gen enthält, getestet. Der Erfolg eines Komplementations-Experiments wurde durch Wechsel des Phänotyps festgestellt. Aus diesen Analysen resultierten folgende Ergebnisse:
ATG9 oder ATG10 können als Translationsstart für funktionelles RegA dienen.
Gezielte Substitutionen von ATG1 bis ATG7 durch TGG resultierten alle in reduzierten Komplementationsraten. Massive Effekte zeigten aber nur die ATG1- und ATG2-Mutationen.
Die Einführung von zwei nonsense Codons in den längsten Leserahmen der 5�NTR (ORF2) resultierte in einer weiteren Reduktion der Komplementationsrate. Das weist ORF2 eine besondere Bedeutung in der regA-Translationskontrolle zu.
Es konnte außerdem ein eigenes orf2-Transkript nachgewiesen werden, daß Intron 2 im Vergleich zur regA-mRNA noch enthält. Im Vergleich mit den Sequenzen aus drei V. carteri-Vertretern weist die ORF2-Region eine erstaunliche Konservierung der DNA-Sequenzen auf. Dies ist ein starkes Indiz für die Signifikanz der Nukleotidsequenze dieser Region.
Eine computergestützte Analyse ergab eine komplexe Haarnadelstruktur im 5�Breich von ORF2, wie sie in einigen anderen Systemen beim ribosome shunting auftritt. Außerdem tritt am Ende von Exon 3 ein zur 18S rRNA komplementärer Bereich auf, der als Ribosomenbindestelle beim ribosome shunting dienen könnte.
Das postulierte Translationskontroll-Modell des ribosome shunting kann alle Ergebnisse dieser Arbeit erklären
