Spektroskopische Aufklärung des Photozyklus der LOV1-Domäne eines Phot-Blaulichtrezeptors

Abstract

Phot-Proteine steuern in ihrer Funktion als sensorische Blaulichtrezeptoren die Anpassung von Organismen an die Lichtverhältnisse in der Umgebung. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus der lichtempfindlichen LOV1-Domäne aus dem Phot-Protein der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii mit Hilfe der transienten Absorptionsspektroskopie untersucht. Die LOV1-Domäne enthält ein Flavin-Mononucleotid als Chromophor. Bei Belichtung geht der Chromophor zunächst in den angeregten Triplettzustand über, der mit zwei Zeitkonstanten von 800 Nanosekunden und 4 Mikrosekunden abklingt. Diese lassen sich einer effizienten Reaktion in das Photoprodukt zuordnen, das sich bei der Reaktion des Triplettzustands mit dem benachbarten Cystein 57 bildet. Das Absorptionsspektrum des Photoprodukts zeigt einen für Flavin-C(4a)-Thiol-Addukte charakteristischen Verlauf mit einem Maximum bei 390 nm. Das Addukt ist nur metastabil und reagiert mit einer Zeitkonstante von 200 s wieder in den Dunkelzustand zurück. Die Kinetik der Rückreaktion hängt stark von den Umgebungsbedingungen wie pH-Wert und Salzkonzentration der Lösung ab. Es wurden deutliche Hinweise darauf gefunden, dass die Rückreaktion auch photochemisch induziert abläuft. Um den Mechanismus der Adduktbildung aufzuklären, wurde in einer Mutante das reaktive Cystein durch ein Methionin ausgetauscht. In der Photoreaktion der C57M-Mutante bildet sich aus einer Reaktion der terminalen Methylgruppe des Methionins mit dem Flavin ein N(5)-Addukt. Dieses Addukt wird in einer thermischen Folgereaktion zu einem Neutralradikal des Flavins oxidiert. Das Produkt enthält eine kovalente Bindung zwischen Chromophor und Apoprotein und ist daher selbst unter aeroben und denaturierenden Bedingungen stabil. Damit unterscheidet es sich deutlich von anderen Flavoproteinradikalen. In der C57M-Mutante kann ein ionischer Mechanismus der Adduktbildung über eine Deprotonierung des Methionins und eine Protonierung des FMN-Triplettzustands weitgehend ausgeschlossen werden. Weitaus plausibler ist hier ein radikalischer Mechanismus, der auch auf die Reaktion des Wildtyps übertragen werden kann