Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Transmembranproteine, die sowohl für die angeborene als auch für die erworbene Immunantwort eine wichtige Rolle spielen. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Regulation von drei TLR-Genen in mononukleären Phagozyten des Menschen und der Maus. Es wurden hauptsächlich die genomischen Strukturen und regulatorischen Bereiche, die sogenannten proximalen Promotoren definiert und regulierende Faktoren identifiziert, die sowohl bei der Regulation der basalen als auch der induzierten Expression des TLR2, TLR3 und TLR4 eine wichtige Rolle spielen.
Zur Charakterisierung der regulatorischen Sequenz des humanen TLR2-Gens wurden Transkriptionsstartpunkte definiert und mittels Datenbankanalysen die Genstruktur ermittelt. Anhand von Monozyten mRNA wurden alternative Spleißvorgänge in Exon II detektiert, welche zu unterschiedlichen Isoformen der TLR2-mRNA führen. Der 5`-regulatorische Bereich des humanen TLR2-Gens wurde festgelegt und in Reporteranalysen weiter charakterisiert. Der proximale Promotor umfasst einen Bereich von 220 bp vor dem Transkriptionsstart. Da der humane TLR2-Promotor in einer CpG-Insel liegt, wurden Methylierungsuntersuchungen durchgeführt. Eine gewebespezifische Methylierung des Promotors war jedoch nicht festzustellen. Anhand von Mutationsanalysen, Gelshiftassays und Kotransfektionen konnte eine wichtige Rolle der Transkriptionsfaktoren Sp1 und PU.1 für die Expression von TLR2 in mononukleären Phagozyten nachgewiesen werden. Eine LPS-Aktivierung von humanen Monozyten führte, anders als in Makrophagen der Maus, zu keiner Induktion von TLR2-mRNA. Eine Hochregulation der humanen TLR2-mRNA nach 3 h war auf die Adhärenz der Zellen an die Plastikschale zurückzuführen und nicht auf eine Stimulation mit LPS.
Die Regulation von TLR3 wurde in mononukleären Phagozyten aus Mensch und Maus untersucht. Anhand semiquantitativer PCR wurde in einem direkten Vergleich der TLR3-Expression beider Spezies eine zelltypspezifische Expression festgestellt. TLR3-mRNA des Menschen kommt spezifisch auf dendritischen Zellen vor, TLR3-mRNA der Maus wird hauptsächlich auf Makrophagen exprimiert. Induktionsanalysen ergaben, dass TLR3-mRNA in beiden Spezies durch IFN-b induziert wird. Die Genstrukturen von humanen und murinen TLR3 wurden ermittelt und anhand von Transfektionsanalysen wurden die regulatorischen Bereiche des TLR3-Gens beider Spezies definiert und charakterisiert. Die Struktur der TLR3-Promotoren hinsichtlich Architektur und möglicher Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren ist in beiden Spezies unterschiedlich, es befinden sich jedoch sowohl in humanen als auch in murinen TLR3-Promotor IFN-regulierte Elemente. Mutationsstudien, Gelshifts und Kotransfektionen ergaben, dass IRF1 und IRF2 die Expression des TLR3-Gens in Mensch und Maus regulieren. Anhand von Knockout-Mäusen konnte geklärt werden, dass die Induktion von TLR3-mRNA in der Maus über den Jak-STAT-IRF-Signalweg verläuft. Die Hochregulation von TLR3-mRNA der Maus durch LPS wird über autokrines IFN-b vermittelt. Im Menschen wird TLR3-mRNA durch LPS nicht induziert und in mit LPS vorstimulierten DC blieb eine durch IFN-b induzierte Hochregulation von TLR3-mRNA aus. Es bleibt noch zu klären, welche Faktoren durch LPS induziert werden, die eine negative Regulation von humanen TLR3-mRNA erklären.
Die Genstrukturen und 5`-Bereiche des TLR4-Gens in Mensch und Maus waren von unserer Arbeitsgruppe bereits identifiziert und mittels Reporteranalysen wurden der humane und murine proximale TLR4-Promotor weiter charakterisiert und miteinander verglichen. Den Transkriptionsfaktoren PU.1 und ICSBP konnte anhand von Mutationsassays und Gelshifts eine wichtige Rolle bei der Regulation des TLR4-Gens sowohl in Mensch als auch in Maus nachgewiesen werden. Der humane TLR4-Promotor war in Transfektionen trotz eines hohen Konservierungsgrades wesentlich aktiver ist als der murine TLR4-Promotor. Um die regulatorischen Bereiche zu charakterisieren, die für die unterschiedliche Aktivität verantwortlich sind, wurden Reporteranalysen mit chimären Konstrukten aus humanen und murinen TLR4-Promotor durchgeführt. Die stärkere Aktivität des humanen TLR4-Promotors wurde vor allem durch Bereiche unterhalb der konservierten PU.1/ICSBP-Site vermittelt, die den humanen Transkriptionsstart enthalten. Das humane und murine TLR4-Gen besitzen durch die unterschiedliche Lage der Transkriptionsstartpunkte eine unterschiedliche Promotorarchitektur. In nachfolgenden Untersuchungen sollen die regulatorischen Sequenzen des TLR4-Gens in Mensch und Maus weiter charakterisiert werden
