Untersuchung zur Vesikel-Andockmodi in neurosecretorischen Zellen mit Totalreflektionsmikroskopie

Abstract

Nach dem Andocken an die Plasmamembran bereiten sich sekretorische Bläschen (Vesikel) in mehreren Schritten auf ihre Ca2+-abhängige Fusion vor. Die molekularen Vorgänge, die sich zwischen dem ersten morphologischen Kontakt mit der Membran und dem Erreichen des fusionsfähigen ( primed ) Zustands abspielen, sind bisher noch ungeklärt. In dieser Arbeit wurde die Totalreflektionsmikroskopie (TIRFM) verwendet, um in Echtzeit einzelne fluoreszenzmarkierte Large Dense Core -Vesikel (LDCV) an der Plasmamembran intakter Nebennieren-Chromaffinzellen zu beobachten. Die TIRFM-Bildgebung wurde mit dem Verfolgen individueller Partikel und mit einer Korrelations- und Aufenthaltszeitanalyse kombiniert, als auch durch stochastisches Modellieren ergänzt, um die molekularen Vorgänge während des Vesikel-Andockens besser zu charakterisieren. Als Modellsystem wurden Zellen von munc18-1 null-mutanten Mäusen verwendet, da dieses t-SNARE Syntaxin-1a-bindende Protein essentiell für das Andocken und die Fusion von Vesikeln ist.Die durch TIRFM-Messungen bestimmete Dichte NPY-Venus-markierter LDCV in den Zellabdrücken spiegelte Veränderungen beim morphologischen Andocken und bestätigte EM-ultrastrukturelle Unterschiede zwischen munc18-1 Null (M18 KO), Wildtyp (WT) und Null+Munc18-1 (Rescue-) Zellen. Eine Analyse der axialen Zitterbewegung gedockter LDCV durch eine Geschwindigkeits-Autokorrelatonsfunktion zeigte eine eindeutige negative Autokorrelationskomponente für kurze t ~0.5-1 s auf, die in M18 KO-Zellen 4-5 mal kleiner war als in WT-Zellen. Die negative Autokorrelations-Amplitude (NPA) konnte bei Rescue-Zellen vollständig und bei Zellen, die mutiertes Munc18-1D34N;M38V mit einer niedrigen Affinität zu Syntaxin-1a oder Munc18-2 überexprimieren, teilweise wiederhergestellt werden. Bei M18 KO-Zellen konnte der Phorbolester PMA das Andocken und die Sekretion wiederherstellen, die NPA hingegen blieb klein. Computer-Simulationen der LDCV Bewegung ergaben, daß die NPA durch die auf das freie Diffusionsmodell angewendete Einschränkungen bestimmt wird. Eine kleine NPA kann entweder auf eine stark eingeschränkte Bewegung durch Käfigbildung oder Bindungskräfte, oder auf eine nahezu freie Diffusion mit nur schwachen Einschränkungen zurückgeführt werden. Da die Bindungskräfte von der Aktin-Zytomatrix bereitgestellt werden könnten, die in M18 KO-Zellen verdickt ist, wurde die Auswirkung einer pharmakologischen Aktin-Depolymerisation auf die NPA untersucht. Die Entfernung des Aktin-Kortex führte zu einer Wiederherstellung des morphologischen Andockens in M18 KO-Zellen bei unveränderter NPA oder Sekretion und deutet so auf ein schwaches und nicht-funktionelles Binden/Andocken der Vesikel in M18 KO-Zellen hin. Um die Aufgabe von SNAREs aufzuklären, wurden SNAP-25A null-mutante Zellen untersucht und eine Neurotoxin-vermittelte Spaltung von SNAREs durchgeführt. Nur die Überexpression der leichten Kette von BoNT-C1 verringerte die NPA. Durch Entwicklung und Anwendung einer automatisierten Analyse der Vesikel-Aufenthaltszeiten an der Membran konnte gezeigt werden, dass sich annähernde Vesikel nur selten andocken und nur einige dieser Besucher durch mindestens zwei verschiedene Bindungsarten eingefangen werden, die eine niedrige oder eine hohe Affinität aufweisen. Munc18-1 vergrößerte sowohl die Population des letzteren Zustands, als auch die Gesamtrate mit der Vesikel zugeführt werden.Schlußfolgernd konnten drei verschiedene Andockzustände identifiziert werden, in denen andockende Vesikel entweder sofort wieder abkoppeln oder durch minimale Andock/Bindungsprinzipien eingefangen und in einen Munc18-1/Syntaxin-abhängigen, fest gebunden, fusionsbereiten Zustand konvertiert werden