Strukturelle und funktionelle Analyse der Präsequenz-spezifischen mitochondriellen Translokase

Abstract

Das mitochondriale Poteom der Hefe Saccharomyces cerevisiae setzt sich aus annähernd 1000 Proteinen zusammen, deren Großteil durch zytosolische Ribosomen synthetisiert wird. Daher sind spezialisierte Transportsysteme nötig, um diese Proteine an ihren Zielort zu leiten. Der TIM23-Komplex ist eine in der inneren Mitochondrienmembran liegende Proteintranslokase und verantwortlich für den Transport von Proteinen mit N-terminalem targeting signal bzw. Präsequenz. Die Erkennung dieser Präsequenz durch Einheiten der Translokase löst eine Reihe von Ereignissen aus, welche signifikante Umformungen innerhalb des Komplexes bewirken, sodass das Protein schließlich in die Matrix entlassen oder in die innere Mitochondrienmembran integriert wird. Untersuchungen der hier beteiligten Proteininteraktionen, besonders während der ersten Schritte, sind jedoch noch ungenügend für ein unstrittiges Modell des TIM23-Mechanismus. In dieser Arbeit wurden die dynamischen Veränderungen der Translokase in Abhängigkeit von Präsequenzen untersucht, wobei Interaktionspartner von Tim50, einer wichtigen TIM23-Komponente, im Mittelpunkt standen. Mit Hilfe einer cross-linking-Methode konnte eine bisher unbekannte Interaktion zwischen Tim50 und Tim21 gezeigt werden, die nach Anfügen einer Präsequenz verschwand. Ko-Immunopräzipitationsexperimente zeigen einen Zusammenhang zwischen dieser neuentdeckten Interaktion und dem Umschalten der Isoformen der Translokase. Folglich scheinen Tim21 und Tim50 hochdynamische Einheiten der TIM23-Translokase zu sein. Ein Gesamtverständnis des Proteintransports durch die Präsequenz-Translokase ist jedoch ohne strukturelle Untersuchungen nicht möglich. Daher war eines der Ziele dieser Arbeit, mit Hilfe von single particle-Elektronenmikroskopie die Struktur des TIM23-Komplexes zu lösen. Dies war jedoch nicht möglich, da das verwendete, für die Stabilität von TIM23 wichtige Detergenz, Digitonin, ein zu starkes Hintergrundsignal verursachte. Trotzdem können wir hier eine nierdrigaufgelöste Struktur eines negative stained TOM-TIM-Superkomplexes und dessen 3D-Rekonstruktion zeigen, wodurch neue Einblicke in die Organisation der Struktur der mitochondrialen Translokationsmaschinerie ermöglicht werden. Zusammenfassend leisten unsere Ergebnisse einen Beitrag zum Verständnis der Präsequenz-Import-Mechanismen und bilden eine Grundlage für weitere strukturelle Untersuchungen der TIM23-Translokase