Thermodynamical and structural characterisation of importinβ dependent nuclear import processes

Abstract

Der aktive Transport von cytoplasmatischen Substraten in den Nucleus wird von Transportrezeptoren vermittelt, welche auch Importine genannt werden. Unter ihnen ist der Kernimportrezeptor Importinβ (Impβ) der wohl vielseitigste: Impβ ist sowohl als einzelner Rezeptor aktiv, als auch im Verbund mit anderen Rezeptoren oder Adaptern. Beispiele für letztere sind der Kernimport von Substraten mit klassischem Kernlokalisationssignal (cNLS-Substrate) gemeinsam mit dem Adapterprotein Importinα (Impα), der Kernimport von H1 Linker Histonen mithilfe des Co-Rezeptors Importin7 (Imp7) und der Kernimport spleißosomaler Untereinheiten, der U snRNPs, im Verbund mit Snurportin1 (SPN1). Diese außergewöhnliche Variabilität von Impβ stand im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit und ihre Ursachen sollten thermodynamisch und strukturell ergründet werden, mit besonderer Fokussierung auf den H1-Kernimport und den Kernimports von U snRNPs. Beim Kernimport von H1 Linker Histonen binden zwar sowohl Impβ als auch Imp7 an das Substrat, jedoch nur als Heterodimer können sie die Translokation von H1 durch die Kernpore bewältigen. In dieser Arbeit konnte die H1-Bindungsstelle von Imp7 ermittelt werden, welche zwei saure Bereiche nahe dem C-Terminus umfaßt, die als mögliche Schleifen identifiziert wurden. Die thermodynamische Analyse der Bildung des H1-Importkomplexes aus Impβ, Imp7 und H1 und seiner Dissoziation durch RanGTP mittels isothermer Titrationskalorimetrie (ITC) zeigte, daß beide Prozesse allosterisch reguliert sind. Dabei konnte dargelegt werden, daß die Bildung des Impβ/Imp7-Heterodimers in vitro enthalpiegetrieben ist, wohingegen die nachfolgende H1-Bindung an das Heterodimer entropiegetrieben ist. Der erforderliche Entropiegewinn wird dabei durch die Freisetzung von Salzionen von der H1-Oberfläche durch die komplementär zu H1 geladene, gemeinsame Oberfläche von Impβ und Imp7 bereitgestellt. Hieraus ist ersichtlich, daß die Energiebarriere bei der H1-Bindung durch den Einsatz eines Rezeptordimers überwunden wird. Außerdem konnte nachgewiesen werden, daß der H1-Bindung eine allosterische Aktivierung von Imp7 durch Impβ vorausgeht, bei welcher die Impβ-Bindungsdomäne von Imp7 eine Schlüsselrolle spielt. Im Kernimport von U snRNPs dagegen bedient sich Impβ nicht eines Co-Rezeptors, sondern eines Adapters für das Substrat, nämlich SPN1. Im Gegensatz zu allen anderen bislang untersuchten Impβ-abhängigen Kernimportprozessen bedarf der Impβ/SPN1/U snRNP-Importkomplex für die Freisetzung vom nuclear basket nach dem Import jedoch nicht des Schalterproteins RanGTP. Die hier vorgestellte Kristallstruktur von Impβ_127-876 im Komplex mit der Impβ-Bindungs-Domäne von SPN1 (IBBSPN1, AS 1-65) offenbart eine weit geöffnete Konformation von Impβ, wie sie einzigartig unter den funktionellen Impβ/Substrat-Komplexen ist. Überraschenderweise gleicht sie vielmehr der Konformation von Impβ/RanGTP. Da die Bindung von RanGTP an Impβ üblicherweise die Freisetzung von Importkomplexen vom nuclear basket auslöst, kann die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die freie Dissoziation von Impβ/SPN1 vom nuclear basket durch die Mimikry des RanGTP-gebundenen Zustands ermöglicht wird. Mittels ITC konnte überdies eine Korrelation zwischen der offenen Konformation von Impβ im Komplex mit IBBSPN1 und seiner hohen Molekülentropie belegt werden. Dies steht im Gegensatz zur geschlossenen und daher entropiearmen Konformation von Impβ im Komplex mit Impα. Die hier vorgestellten Ergebnisse verdeutlichen also die zentrale Rolle von molekularen Modulationen im Impβ-abhängigen Kernimport und geben neue Einblicke in Strategien, die Energiebarrieren im Kernimport zu überwinden