thesis

Development of a Basic Biosensor System for Wood Degradation using Volatile Organic Compounds

Abstract

Die Prüfung von Holz und ein Test seiner Beständigkeit gegen Mikroorganismen wie Pilze spielen eine wichtige Rolle in der Forstwirtschaft und der holzverarbeitenden Industrie. Um solche Prüfungen zu erleichtern und präzise Bewertungen zu ermöglichen, ist eine effiziente Testmethode erforderlich. Flüchtige organische Verbindungen (volatile organic compounds VOCs), die vom Holzsubstrat und vom pilzlichen Metabolismus erzeugt werden, sind Marker für den Zustand des Holzes, d.h. sie zeigen Art und Stadium einer Pilzinfektion an. Insektenantennen, die für ihre hohe Sensitivität und Selektivität in der Duftwahrnehmung bekannt sind, stellen eine alternative Methode zur Holzprüfung dar. Ein Biosensor auf der Basis intakter Insektenantennen ermöglicht es, vom Holz freigesetzte VOCs mit hoher Selektivität nachzuweisen. Diese Methode kann eine Ergänzung zu den traditionellen Prüfverfahren darstellen und bietet einen hohen Probendurchsatz sowie ein zerstörungsfreies Verfahren. Als Beginn dieser Arbeit wurden die VOCs verschiedener Proben mit Gaschromatographie-Massenspektroskopie untersucht. Zuerst wurden die VOCs von Buchenholz (Fagus sylvatica) analysiert, das mit drei holzzersetzenden Pilzen (Trametes versicolor, Poria placenta und Gloeophyllum trabeum) infiziert war. Diese Pilze werden häufig verwendet, um die Beständigkeit von Holz gegen Mikroorganismen zu testen. Die vom pilzinfizierten Buchenholz freigesetzten VOCs zeigten artspezifische Muster. Die Volatile lassen sich gruppieren in Stoffe mit fünf bis acht Kohlenstoffen (C5-C8) sowie Terpenoide. 1-Octen-3-ol, 3-Octanon und 3-Octanol (C8-Verbindungen) waren allgemein in allen Proben enthalten, während Terpenoide artspezifisch auftraten. α- und β-Barbaten waren charakteristisch für eine Infektion mit T. versicolor, Protuillud-6-en war charakteristisch für G. trabeum und Daucen war charakteristisch für P. placenta. Als Zweites wurden VOCs identifiziert, die von verschiedenen Stadien von Trametes gibbosa mit schwacher bis vollständiger Kolonisierung durch den Käfer Cis boleti freigesetzt wurden. Die schwach besiedelten Fruchtkörper setzten den typischen Pilzduftstoff 1-Octen-3-ol in fast zwanzigfach höherer Menge frei als vollständig besiedelte Fruchtkörper. Als Drittes wurden die VOCs untersucht, die während der Fruchtkörperentwicklung vom Stadium des Myceliums bis zur Autolyse von Coprinopsis cinerea freigesetzt werden. Die VOC-Muster von C. cinerea änderten sich spezifisch mit den Entwicklungsstadien. 1-Octen-3-ol und 3-Octanon zeigten während der Bildung der Primodia eine starke Freisetzung, die in späteren Stadien abnahm. Die Terpenoide β-Himachalen und Cuparen wurden während Wachstum und Reifung des Stängels von C. cinerea drastisch erhöht. Zum Abschluss wurden die autolytischen Fruchtkörper der Tintlinge Coprinus comatus, Coprinopsis atramentaria und C. cinerea untersucht. Als zusätzliche Stoffe wurden hier stickstoff- und schwefelhaltige Verbindungen freigesetzt. Der fungivore Käfer Cis boleti (Coloptera: Ciidae) und die pilzassoziierte Fliege Suillia mikii (Diptera: Heleomizydae) wurden ausgewählt, um ihre geruchliche Wahrnehmung zu untersuchen, da ihre Lebenszyklen einen starken Bezug zu Pilzen haben. Zum Beispiel kolonisiert C. boleti vorzugsweise Pilze der Gattung Trametes und S. mikii landen gezielt auf Tintlingen in spezifischen Entwicklungsstadien. Gaschromatographie-Massenspektrometrie mit paralleler elektroantennographischer Detektion (EAD) wurde eingesetzt, um zu demonstrieren, dass beide Insektenarten in der Lage sind, den typischen Pilzgeruchsstoff 1-Octen-3-ol mit hoher Selektivität und Sensitivität nachzuweisen. Zusätzlich zeigten Verhaltenstests, dass C. boleti in der Lage ist, die Enantiomere von 1-Octen-3-ol zu unterscheiden, wobei weibliche Käfer signifikant stärker vom (S)-(+)-Enantiomer angelockt wurden und dies schon bei geringeren Konzentrationen als die männlichen Käfer. Die Fliege S. mikii reagierte in EAD-Tests reproduzierbar auf die VOCs 1-Undecene, 2-Butanon und Dimethyl-Trisulfid, die bei der Autolyse der Fruchtkörper von Tintlingen freigesetzt werden. Die Antennen von C. boleti detektierten den typischen Pilzgeruch 1-Octen-3-ol mit hoher Selektivität und Sensitivität bis zu einer Konzentration von 5 ng ml-1 in Luft. Die Lebensdauer der Antennen betrug bis zu ein Tag. Als grundlegender Test wurden Antennen von C. boleti als Biokomponenten eines Biosensorsystems benutzt, um Buchenholzproben mit Infektion durch T. versicolor zu untersuchen. Dazu diente ein Biosensorsystem, das auf der Überlagerungsmethode in Verbindung mit einem Rekalibrierungssystem basiert. In dieser Konfiguration lieferten die Antennen von C. boleti reproduzierbare Reaktionen auf die pilzlichen Markerstoffe, die von pilzinfiziertem Buchenholz freigesetzt werden. Zusammengefasst führen diese Ergebnisse zu einer aussichtsreichen Möglichkeit, einen Biosensor auf Basis von intakten Antennen als hoch empfindliche und selektive Testmethode für die Holzbeständigkeit gegen zersetzende Pilze zu entwickeln

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