Genome wide cDNA library screen for new signaling associated modulators of cardiac hypertrophy and heart failure

Abstract

Die MAPK Signalkaskade wird durch Cytokine, Wachstumsfaktoren und Hormone aktiviert und reguliert die Antwort der Zelle auf diese extrazellulären Signale. So ist die Signalkaskade an fundamentalen Funktionen der Zelle, wie Wachstum, Proliferation, Differenzierung und Überleben beteiligt. Durch diese zentrale Rolle in der Signaltransduktion können Störungen der MAPK Signalkaskade eine verheerende Auswirkung auf die Zelle und ihren Organismus haben. Die Proteine der MAPK Signalkaskade wurden bereits mit vielen Krankheiten wie Krebs, Autoimmunerkrankungen und Herzinsuffizienz in direkten Zusammenhang gebracht. Die konstitutive Aktivierung der MAPK Signalkaskade im Herzen führt zu kardialer Hypertrophie mit anschließender Herzinsuffizienz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass B-Raf in der Regulation kardialer Hypertrophie eine Rolle spielt. Um dies zu ermitteln, wurde im Modell kultivierter neonataler Kardiomyocyten der Ratte, die Zellgröße planimetrisch untersucht. Die Zellen wurden dabei mittels Phenylephrin zur Hypertrophie angeregt. Die B-Raf Aktivität wurde durch den kommerziell erhältlichen Inhibitor SB590885 inhibiert. Zellen, die simultan mit Phenylephrin und dem Inhibitor SB590885 behandelt wurden, entwickelten keine zelluläre Hypertrophie der neonatalen Kardiomyocyten. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Inhibition von B-Raf, in den neonatalen Kardiomyocyten der Ratte, zu einer signifikanten Reduktion der Mek1/2 Phosphorylierung führt. Dies wurde sowohl in den unstimulierten Kardiomyocyten, als auch in den durch Phenylephrin stimulierten Kardiomyocyten sichtbar. Auf Grundlage dieser Ergebnisse ist anzunehmen, dass es sich bei B-Raf um die RAF-Isoform handelt, die für die Signalweiterleitung an Mek verantwortlich ist. Dies geschieht entweder direkt oder mittelbar durch die Rekrutierung von C-Raf. Die Signalübertragung von B-Raf zu Mek stellt eine wichtige Schlüsselstelle der MAPK Signalkaskade dar. Daher wurde innerhalb der vorliegenden Studie nach bisher unbekannten Proteinen gesucht, die Modulatoren der Signalübertragung von B-Raf zu Mek sind. Hierzu wurde unter Verwendung einer cDNA Library in einem genomweiten Ansatz ein Luciferase Reporterassay etabliert. Innerhalb dieser Studien wurde Rcn1 als Inhibitor der B-Raf/Mek1 Interaktion identifiziert. Daher wurde Rcn1 im Anschluss daran in weiteren Analysen und Experimenten genauer charakterisiert. Die Rcn1 Expression ist in der kardialen Hypertrophie sowohl in Mensch als auch in Maus signifikant erhöht. Innerhalb der vorliegenden Untersuchungen konnte Rcn1 erstmals als Regulator der kardialen Hypertrophie identifiziert werden. Rcn1 ist in der Lage die Phenylephrin induzierte Hypertrophie in vitro vollständig zu inhibieren und sowohl die B-Raf als auch die C-Raf Kinaseaktivität potent zu inhibieren. Neonatale Kardiomyocyten, die Rcn1 überexprimieren, entzogen sich ebenso wie die B-Raf inhibierten Zellen der Phenylephrin induzierten Hypertrophie. Die Überexpression von Rcn1 in den neonatalen Kardiomyocyten der Ratte führte zu einer dosisabhängigen Inhibition der Mek1/2 Phosphorylierung. Der Knockdown von Rcn1 führte dabei zu einer erhöhten Mek1/2 Phosphorylierung in den neonatalen Kardiomyocyten der Ratte. Dieses Ergebnis wurde sowohl mittels Western-Blot Analyse als auch im Luciferase Reporterassay bestätigt. Die Untersuchung ergab zudem, dass der Knockdown zu einem hypertrophen Wachstum der Kardiomyocyten führte. Die Expression von Rcn1 scheint in den neonatalen Kardiomyocyten notwendig zu sein, um das hypertrophe Wachstum der Zellen zu inhibieren