Konfokalmikroskopische Analyse von strukturellen und funktionellen Veränderungen an neuromuskulären Terminalen lebender Larven der Fruchtfliege Drosophila melanogaster

Abstract

Bisher war es nicht möglich, die Entstehung neuer glutamaterger Synapsen in vivo zu beobachten. In dieser Arbeit wurden Protokolle etabliert, die die Beobachtung einzelner postsynaptischer Rezeptorfelder in einem definierten Zeitintervall erlauben. Hierzu wurden transgene Fliegenstämme etabliert, die es ermöglichten, Glutamatrezeptoren in lebendigen Fruchtfliegenlarven zu verfolgen und deren Mobilität zu quantifizieren. Das starke Wachstum der neuromuskulären Terminalen erlaubt es, mechanistische Fragen bezüglich der Entstehung neuer synaptischer Kontakte im Kontext von etablierten neuronalen Verbindungen zu stellen. Es konnte gezeigt werden, dass sich neue funktionelle Synapsen in der Regel entfernt von etablierten Synapsen bilden und dann schnell auswachsen. Hierbei scheint der Import der Glutamat-Rezeptor Untereinheit DGluRIIA das Wachstum des Rezeptorfeldes zu kontrollieren. Mit Hilfe von in vivo Bleich- und Photoaktivierungs- Experimenten konnte gezeigt werden, dass neu synthetisierte oder diffus verteilte, nicht synaptisch lokalisierte Rezeptoren selektiv in wachsende Synapsen integriert werden. Eben dieses Auswachsen neuer Rezeptorfelder und nicht die Teilung etablierter Rezeptorfelder scheint für die langfristige Stärkung der synaptischen Verbindung verantwortlich zu sein. Bereits etablierte Rezeptorfelder sind hingegen stabile Einheiten. Sie zeigen nur sehr geringen Import von neuen Rezeptoren, und keinen messbaren Export oder Verlust von Rezeptoren. Um die Koordination des Auswachsens pre- und postsynaptischer Strukturen aufzuklären, wurden zwei komplementäre Ansätze gewählt. Zum einen wurde ein Genom-weiter Screen initiiert, in dem Proteine an ihrem endogenen Locus mit GFP markiert wurden. Der Screen selbst wurde mit piggyBAC / P-Element Hybrid-Transposon durchgeführt. Hierbei wurden positive Larven mit Hilfe eines automatischen Embryonen-Sorters isoliert. Des Weiteren wurde das erste Protein, das in Drosophila an die Cytomatrix der aktiven Zone lokalisiert, identifiziert (Drosophila CAST). Dies stel lt den ersten Schritt zu dessen molekularer Charakterisierung dar und ermöglicht die simultane Visualisierung des Auswachsens pre- und postsynatischer Strukturen