関根 秀一

関根, 秀一

Tokyo Women’s Medical University

(第39回未来医学研究会大会より<特集I>)フロントランナー報告未来医療実現を目指した補助ポンプ型心筋組織の開発著者名 関根 秀一雑誌名 未来医学号 30ページ 27-31発行年 2017-03-15URL http://doi.org/10.20780/00031715未 来 医 学   No.30 2017　27はじめに先天性心疾患や虚血性心疾患、特発性心筋症などが起因となり心臓のポンプ機能が高度に低下してしまう難治性の重症心不全に対して、現在、心臓移植が最も有効な治療法であるがドナー不足が大きな問題となっており、また左室補助装置の使用は、感染や血栓形成などの問題があり長期的生命維持は困難なのが現状である。そこで新たな治療法として再生医療が注目され、これまでに筋芽細胞や骨髄由来細胞、または心臓幹細胞を不全心筋組織内へ注入することにより心筋組織を再生させる細胞移植療法がすでに臨床応用されている。しかし、細胞懸濁液注入による治療はバラバラになった細胞が移植されるため、移植位置を制御することの難しさや移植部からの流出や壊死による細胞の損失が大きな問題となっている。これらの問題を解決するために予め生体外で細胞を組織化するというティッシュエンジニアリングによる研究開発が世界中で盛んに行われている。本稿ではティッシュエンジニアリング手法の一つである細胞シート工学によって構築した心血管組織と近未来の治療法を目指した補助ポンプ型心筋組織の研究開発について紹介する。細胞移植による心筋の再生治療心筋に対する細胞移植の研究が始まったのは1990年代前半で、心臓に移植されたマウス胎児心筋細胞がホスト心筋に生着することが示された1。その後、心筋細胞のみならず細胞注入療法は心機能の回復を助けることが報告された2。また心筋再生における細胞ソースの一つとして骨格筋の筋芽細胞が代替として用いられ、2003年には患者本人の骨格筋より採取した筋芽細胞の移植を冠動脈バイパス術と併用して行うことで心機能が回復することが報告された3。しかし不整脈を引き起こし死亡する例もあったため、抗不整脈薬や植込み型除細動器の併用が必須であった。近年、高い心筋分化能力ならびに増殖能を持つ細胞ソースとして盛んに研究されているのはES細胞とiPS細胞で、ともにヒト細胞からの心筋細胞への分化誘第39回未来医学研究会大会より特集 Ⅰフロントランナー報告未来医療実現を目指した補助ポンプ型心筋組織の開発東京女子医科大学 先端生命医科学研究所関根 秀一Hidekazu Sekine第39回未来医学研究会大会より特集Ⅰ28　Fu t u re  Med ic i ne   No.30 2017導法も確立され、心不全動物モデルへの移植実験においても分化誘導させた心筋細胞はホストの心臓に生着し心機能が改善されることも示されている4, 5。ティッシュエンジニアリングによる心筋組織の構築生体内や培養系で体の機能組織を構築させるティッシュエンジニアリングは、1980年代後半に提唱され医学と工学の融合により生まれた学際的な学問である。そして組織の再生には細胞と細胞の足場となる細胞外マトリックスや細胞の分化・増殖のための増殖因子が必要であるとし、その足場材料としては生分解性のポリ乳酸やその共重合体からなる三次元スキャフォールドが用いられた。この方法はスキャフォールドに細胞を播種し培養に生体内へ移植するが、移植後には高分子が緩やかに分解・吸収され、細胞が産生する細胞外マトリックスと置換されるため、結果的に生体様の組織構造が再生できるというものである6。ティッシュエンジニアリングを用いることの利点は、細胞注入療法で課題となっている細胞の流出や壊死による細胞の損失を克服できること、また先天性心疾患など欠損部位に対する治療を可能としうることである7。現在、スキャフォールドとしてゼラチン、アルギン酸またはポリグリコール酸の多孔性スポンジ、あるいは脱細胞化組織などを用いた研究が行われている8, 9, 10, 11。またコラーゲン溶液と心筋細胞を混ぜモールド内で培養することにより任意形状の心筋組織を構築する開発も報告されており、この研究ではin vitroでの伸展負荷により心筋組織に配向性を持たせ、さらに心筋細胞を肥大させることも示されている12。細胞シート工学による心筋組織の構築組織構築を行う際に細胞の足場として三次元スキャフォールドを用いる方法は、実際にはスキャフォールド内部へ十分に細胞数を播種することが難しく、結果として細胞成分が少なく大量の結合組織が多い組織ができあがってしまう。つまり心臓弁や軟骨など細胞が疎な組織の作製には適するが、心臓や腎臓、肝臓など細胞が密で複雑な構造と高い機能を持つ組織を作製するには次の新たな技術開発が必要となっていた。このような中、我々はスキャフォールドフリーで組織を構築する細胞シート工学を用いて心筋組織構築の研究開発を進めてきた。細胞シート工学とは培養皿表面に温度応答性の高分子（N-イソプロピルアクリルアミド）を修飾することで32℃を境に温度変化のみで細胞の接着・脱着を制御できるという技術である。従来、培養細胞を回収するにはプロテアーゼを使用するが、この方法では細胞と培養皿表面を接着させている接着蛋白を分解するばかりか細胞膜表面の蛋白までも分解してしまう。しかし温度応答性培養皿を使用した場合は、温度を降下させるだけで細胞間接着や細胞外マトリックスを破壊することなく細胞をシート状に回収が可能で、積層化することにより三次元組織を構築できる。積層化により構築された組織は培養された細胞自身が産生する細胞外マトリックスのみからなるためスキャフォールドを使用する時に生じる問題を回避できる13。まず初めに、新生仔ラット心筋細胞シートを作製し積層化を行うことでin vitroにおいて心筋細胞シート間に数十分で電気的な結合が形成され、同期して自律拍動する組織が作製できることを示した14, 15。次に積層化心筋細胞シートをラット皮下組織に移植すると、ホスト心臓の心電図とは異フロントランナー報告未来医療実現を目指した補助ポンプ型心筋組織の開発未 来 医 学   No.30 2017　29なる心筋グラフトに固有の電位が測定され、マクロ観察で拍動を確認できるレベルであった。移植組織内には毛細血管が新生し、心筋組織は円柱状に伸長したサルコメア構造やギャップジャンクションまたはデスモソームなど生体組織に類似した組織像であった16。この移植された心筋グラフトは拍動を維持したままラットの寿命である約2年間の間、生着し続けることも示した17。心筋細胞シートの心不全モデルへの移植においては、心筋グラフトとホストの正常心筋との間に心筋細胞同士の結合が起こるとともに、それらの細胞間にギャップジャンクションが形成され電気的な結合が確立されることも示した18。また細胞注入療法に比べ細胞の生着率が圧倒的に良いことも明らかにした19。さらに内皮細胞と心筋細胞を共培養した細胞シートでは内皮細胞の網目状ネットワークが構築され、その心筋グラフトを移植すると網目状の血管内皮細胞のネットワークがダイレクトに血管新生に寄与し虚血心の機能回復を加速させることも示した20。構築心筋組織のスケールアップ組織の高機能化には再生組織内へ血管網の付与を行い、酸素・栄養の透過性を向上させ老廃物も排出を図る必要があるが、一つの方法として、最初に移植した積層化心筋細胞シートにホスト側からの血管新生を待ち新たな積層化心筋細胞シートを段階的に移植することを考案した。そしてin vivoにおいて約1mmの収縮力が増大した心筋組織を再生させることを可能とした21。次に、in vivoで結果を受けてin vitroで組織内へ血管網を付与することで厚みのある心筋組織の構築を試みた。まず血管新生の場となる血管床と組織灌流用バイオリアクターを開発し、血管床上へ積層した心筋細胞シートへの毛細血管新生の評価を行った（図1）。血管床は血管付きの骨格筋組織を用い外科的処理によって毛細血管の動静脈短絡を誘導させ灌流液が動脈から組織へ渡り、静脈へ戻るような組織を作製した。内皮-心筋共培養細胞シートを血管床上へ積層化し線維芽細胞増殖因子を添加した灌流液を用いて灌流培養を行うことで心筋組織内において再生された毛細血管と血管床の毛細血管との間に血管を介した繋がりができることを確認した。また積層化細胞シートを段階的に積層化行うことで約200μmのより厚みのある心筋組織の構築を可能とした22。これによりin vitroで再生組織内へ機能的な血管網の付与を可能とし、細胞シートの段階的積層による組織スケールアップを実証した。補助ポンプ型管状心筋組織の構築我々はさらに効果的な治療法の開発を目指し、細胞シート工学による次の展開として補助ポンプ内皮-心筋共培養細胞シ トー積層化細胞シ トー血管床上への積層化血管付き心筋組織血管内皮細胞データ解析装置潅流制御システム送液ローラーポンプ潅流液調整タンク 廃液タンク血圧計 組織潅流チャンバー細胞シ トー血管床pHセンサー流量計 空気混合ガス炭酸ガス図1　 心筋組織への生体外における血管網付与システム。内皮-心筋共培養細胞シ トーを吻合移植可能な血管付き血管床の上へ段階的に積層化しバイオリアクターをもちいて組織潅流培養を行う。第39回未来医学研究会大会より特集Ⅰ30　Fu t u re  Med ic i ne   No.30 2017となりうる管状心筋組織の構築に着手している。これまでに、管状フィブリンゲル足場の外周に心筋細胞シートを巻きつけることにより管腔内圧を生じる管状心筋組織の作製に成功させた23。また心筋細胞シートを大動脈外周に巻きつけることで移植可能な管状心筋組織を構築し大動脈との置換移植を行った （図2）。その結果、置換移植後においてホストとは異なる管状心筋組織単独の自律拍動が確認でき、内圧測定では最大で8.1mmHgの内圧較差が計測された。組織切片では動脈の外周に巻き付けた心筋組織の生着が認められ、規則正しい筋節構造、多くのミトコンドリアおよびデスモソームが確認された。またin vivoにおける動脈の拍動条件下で心筋組織が収縮進展を繰り返されることにより成長肥大が促されることも示した24。内圧測定により圧格差が生じたことはホストの血行動態を変化させ得る可能性を示しており、細胞シート工学を用いることで補助ポンプ型心筋組織が作製できる可能性を示唆する結果となった。現在は、iPS細胞由来ヒト心筋細胞を用い、前述したin vitro組織スケールアップ技術を管状心筋組織の構築に応用し、より厚く収縮力が増大した補助ポンプ型ヒト管状心筋組織の開発研究を進めている。おわりに血液循環を制御可能とする補助ポンプ型心筋組織の臨床応用には、ヒトへ移植可能な心筋細胞や血管構成細胞の獲得や構築組織のスケールアップなどの大きな課題を克服する必要があるが、他分野の研究者と共に学際的な技術開発を強力に推し進めることで、そう遠くはない未来に達成できるものと考える。血管外周への心筋細胞シ トー巻き付け管状心筋組織の置換移植大動脈図2　 補助ポンプ型管状心筋組織の作製と移植。生体外にて大動脈周囲へ心筋細胞シートを連続的に巻付け、培養することで管状心筋組織を構築する。その後、置換可能な動脈へ移植を行う。平成11年3月 国際医療福祉大学 保健学部 卒業平成15年3月 国際医療福祉大学大学院 医療福祉学研究科 博士前期課程 修了平成20年8月 自治医科大学 博士（医学）平成20年11月 東京女子医科大学 先端生命医科学研究所 助教平成25年4月 東京女子医科大学 先端生命医科学研究所 講師略 歴フロントランナー報告未来医療実現を目指した補助ポンプ型心筋組織の開発未 来 医 学   No.30 2017　31■参考文献  1） Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, et al. 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Biomaterials. 2007; 28: 3508.24） Sekine H, Shimizu T, Yang J, et al: Pulsatile myocardial tubes fabricated with cell sheet engineering. Circulation 2006; 114: I87.

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