Evaluation of π-π interactions in proteins using Trp analogs:From protein labeling to quantitating the energies involved

Abstract

Zijketens van aromatische aminozuren zijn vaak betrokken bij kation-π en π-π interacties. Hoewel deze interacties belangrijk zijn voor de stabiliteit en functie van eiwitten, is slechts weinig fundamentele kennis beschikbaar over de sterkte van deze interacties. Een elegante methode om hierin inzicht te krijgen is via het inbouwen van aromatische aminozuren met één tot vier fluoratomen in de zijketen. Echter, de bestaande methoden om deze eiwitten te produceren geven extreem lage opbrengsten. In dit proefschrift wordt een Lactococcus lactis tryptofaan auxotroof expressiesysteem beschreven om deze eiwitten in milligram hoeveelheden en met een hoge inbouwefficiëntie (≥ 95%) te produceren. Gebruik werd gemaakt van een synthetisch groeimedium dat uit slechts 24 componenten bestond, terwijl de meest gebruikte synthetische media voor L. lactis veelal 50 componenten bevatten. Met dit expressiesysteem werd een reeks tryptofaan analogen ingebouwd in het LmrR eiwit. LmrR is een translatie repressor eiwit dat dimeren vormt en aromatische liganden kan binden tussen twee tryptofaan residuen in het dimeergrensvlak. Gevonden werd dat, naarmate meer fluor atomen aanwezig waren in de tryptofaan zijketen, des te lager werd de affiniteit van LmrR voor zijn liganden. Dit is een sterke aanwijzing dat π-π interacties een belangrijke rol spelen om het ligand te binden. Hoge-resolutiestructuren van LmrR met gebonden ligand bevestigen dat de inbouw van fluoratomen in een aromatisch aminozuur geen grote structurele veranderingen induceert. Het hier gepresenteerde L. lactis tryptofaan auxotroof expressiesysteem maakt het nu dus mogelijk om voldoende eiwit te maken om π-π interacties te bestuderen met diverse biofysische methoden