De erfelijke eigenschappen van levende organismen zijn vastgelegd in DNA molekulen in de vorm van een specifieke volgorde van de basen adenine, cytosine, guanine en thymine. Het essentieel voor de ontwikkeling van levende organisemen, dat de DNA molekulen zeer vaak gedupliceerd kunnen worden zoder dat de vastgelegde code noemenswaardig veranderd. Dit vereist een extreem hoge stabiliteit van het DNA molekuul. In schijnbare tegenspraak hiermee is het feit, dat het DNA wordt blootgesteld aan een groot aantal externe factoren, die de genetische code kunnen verminken. Een van die factoren is het ultraviolet licht. De belangrijkste schade veroorzaakt door ultraviolet licht is het thymine dimeer, dat op twee manieren kan worden gevormd. ... Zie: Samenvattin

Kemmink, Johan

University of Groningen Research Database

  
 University of Groningen
Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies
Kemmink, Johan
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from
it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
1987
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Kemmink, J. (1987). Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 10-02-2018
l r
- r $
l--'
l*-
l
I
; ' -  -
h
l:: -
I
*ffi,,
a . . ,
SAMENVATTING
De erfelijke eigenschappen van levende organismen zijn vastgelegd in
DNA rnolekulen in de vorm van een specifieke volgorde van de basen
adenine, cytosine, guanine en thymine. Het is essentieel voor de
ontwikkeiing van levende organismen, dat de DNA rnolekulen zeer
vaak gedupiiceerd kunnen worden zonder dat de vastgelegde code
noemenswaardig veranderd. Dit vereist een extreem hoge stabiliteit
van het DNA molekuul. In schijnbare tegenspraak hiermee is het feit,
dat het DNA wordt blootgesteld aan een groot aantal externe
factoren, die de genetische code kunnen verminken. Een van die
factoren is tret ultraviolet licht. De belangrijkste schade veroorzaakt
door ultraviolet licht is het thymine dimeer, dat op twee manieren
gevormd kan worden:
a. directe absorptie van ultraviolet licht (X x 26A nrn) door een
thymine base
b. absorptie van licht (À - 300 nm) door een ander molekuul (een
sensibilisator) waarna de energie wordt overgedragen aan een
thymine base.
Er blijken echter een aantal natuurlijke reparatie mechanisrnen te
bestaan, die de aangerichte schade kunnen herstellen. Een van deze
mechanismen is de fotoreparatie, die wordt gekatalyseerd door
fotoreactiverende enzymen. Deze enzyrnen fi.rngeren in feite als
sensibilisator in de splitsingsreactie van het thymine dimeer.
In dit proefschrift worden de resultaten gepubliceerd van een
proton NMR onderzoek naar een aantal eigenschappen van thymine
dimeren. Aan de orde komen het mechanisme van de splitsing van
thyrnine dimeren, de chemische structuur van thymine dimeren en de
veranderingen, die ze teweeg brengen in de conformatie van DNA.
In hoofdstuk I wordt het proefschrift ingeleid rnet een korte
beschrijving van:
a. de fotochemie van DNA met de nadruk op de thymine dimeren
b. de natuurlijke mechanismen, die de fotochemische schade in DNA
ongedaan kunnen maken
3"
| : * -
t
F"*
! m
I
l ,
t
l
123
c. de NMR technieken, die toegepast zijn om de verschiilende model
systemen te onderzoeken.
Het mechanisme van de gesensibiliseerde splitsing van thymine
dimeren wordt beschreven in hoofdstuk II. Als model systeem is de
fotoreactie tussen de sensibilisator antrachinon (AQ) en cis-syn
dimethyithymine dimeer (DMTD) gekozen. Verstoringen van de
normale NMR iijnintensiteiten (het foto-CIDNP effect) op de
resonantie posities van het monomeer dimethylthymine (DMT) tonen
aan, dat de splitsingsreactie verloopt via een ion radikaal paar
bestaande uit het kation radikaal DMT]- en het anion radikaal AQ.
Uit tijdsafhankelijke foto-CIDNP metingen blijkt, dat de CIDNP
effecten binnen 0.2 ps na initiatie van de fotoreactie ontstaan, hetgeen
een indicatie geeft voor de snelheid van het splitsingsproces. Vrij in de
oplossing bewegende kation radikalen DMTt compenseren het
CIDNP effect weer gedeeltelijk door disproportionerings reacties.
In hoofdstuk iII komt het belangrijkste model systeem, dat in dit
proefschrift wordt beschreven, aan de orde: Een duplex bestaande uit
de twee komplementaire DNA strengen d(GCGTTGCG) en
d(CGCAACGC). Bestraling van dit duplex met ultraviolet licht heeft
dimerisatie van ca. 370 van de thymines tot gevolg. Hetzelfde thymine
dimeer, dat in DNA in principe in vier isomere vormen voor kan
komen, wordt gevormd na bestraling van de enkele streng
d(GCGTTGCG) met een opbrengst van ca.207o. Na scheiding van het
gedimeriseerde en niet-gedimeriseerde enkel strengs materiaal wordt de
komplementaire streng d(CGCAACGC) in een i:1 verhouding aan de
thymine dimeer streng d(GCGTTGCG) toegevoegd. Om aan te tonen,
dat een dergelijk duplex representatief is voor natuurlijk DNA met
stralingsschade, wordt het thymine dimeer duplex samengebracht met
een fotoreactiverend enzym verkregen uit de cyanobacterie Anacystis
]{idulans en bestraald met zichtbaar licht. Met optische en NMR
spectrosopie wordt aangetoond, dat het oorspronkelijke duplex weer
teruggevormd wordt.
Bestraling van het dinucleotide d(TpT) in aanwezigheid van de
sensibilisator acetofenon levert twee isomere thymine dimeren op in
een verhouding van 6:l (hoofstuk IV). Na zuivering kunnen beide
produkten met behuip van 2D NMR technieken (2D NOE en COSY)
geidentificeerd worden. Het fotoprodukt met de hoogste opbrengst
blijkt het cis-syn isomeer te zijn met beide l/-glycosidische bindingen in
de ANTI conformatie. Het andere fotoprodukt is het ïrons-syn isomeer
rnet de l/-glycosidische binding van het nucleotide aan de 5'kant in de
124
h
I
SYN conformatie en de N-glycosidische binding aan de 3'kant in de
ANTI conformatie. Uit een analyse van de "/ koqPelings-konstanten
van de desoxyribose protonen in het cis-syn d(TpT) blijkt, dat de
voornaamste conformatie van de desoxyribose behorend bij het
nucleotide aan de 3'kant sterk veranderd is ten opzichte van het niet-
gedimeriseerde dinucleotide (l'-exo in plaats van 2'-endo). De
conformaties van de desoxyribose van het 5'nucleotide zijn
vergelijkbaar met die in het niet-dimeriseerde dinucleotide. In het
trans-syn isomeer vertonen beide desoxyriboses een afwijkend gedrag:
Een voorkeur voor een pure 2'-endo conformatie wordt waargenomen.
De hoofdstukken V, VI en VII zijn gewijd aan een nadere
analyse van het dubbel strengs octameer d(GCGTTGCG).
d(CGCAACGC). De eerste stap is een zo volledig mogelijke spectrale
toekenning van de protonen. In hoofdstuk V wordt de toekenning van
de niet-uitwisselbare protonen beschreven. Met behulp van 2D
homonucleaire Hartmann-Hahn en 2D NOE spectroscopie worden
alle base-protonen en de meeste desoxyribose protonen toegekend. Ter
vergelijking wordt dit ook met het dubbel strengs octameer zonder
thymine dimeer gedaan. Hieruit blijkt dat het bestraalde octameer een
cis-syn thymine dimeer bevat van het cyclobutaan type. Een
vergelijking van de 2D NOE spectra en de proton chemical shifts van
beide dubbel strengs octameren toont aan, dat thymine dimeer
vorming niet veel invloed heeft op de normale B-DNA structuur:
Verstoring van de structuur blijft beperkt tot een gebied van ten
hoogste vier base-paren.
De dubbele helix structuur van DNA wordt gestabiliseerd oor
waterbruggen tussen de basen adenine en thymine enerzijds en
cytosine en guanine anderzijds. In hoofdstuk VI wordt de invloed van
thymine dimeer vorming op de stabiliteit van de dubbele helix
besproken. Uitstekende probes hiervoor zlin de uitwisselbare imino-
protonen van thymine en guanine, die normaliter betrokken zijn in de
waterstoÍbruggen. Op de imino-protonen van de eindstandige base-
paren na kunnen alle imino-protonen in het thymine dimeer duplex
worden gedetecteerd en toegekend. Uit een vergelijking met het imino-
proton spectrum van het duplex zonder thymine dimeer volgt, dat de
GC base-paren volledig intact blijven. De twee AT base-paren worden
echter aanzienlijk verzwakt door thymine dimeer vorming. Het gevolg
is een daling in de smelttemperatuur van de dubbele helix van l3o C.
In hoofstuk VII worden NMR spectroscopie n theoretische methoden
gecombineerd om de structuur van het thymine dimeer duplex te
i.|: 
_.-
| ! J I
E . r -  r i - -
* r  - - , , . -
tso
F||*- -:
] b * : : - -
bour
]  *  - -
t25
berekenen. Uit een serie 2D NOE spectra opgenomen met
verschillende mengtijden konden met een redelijke nauwkeurigheid
(i l0%o) I 13 proton-proton afstanden in het thymine dimeer duplex
worden opgemeten. In energie-minimalisatie (EM) en molekulaire
dynamica (MD) berekeningen werden deze afstanden als
randvootwaarden meegenomen. Het resultaat van de berekeningen is
een structuur, die gemiddeld genomen van het B-type is. Sommige
locale conformatie parameters vertonen echter behoorlijke afwijkingen
ten opzichte van hun waarden in normaal B-DNA. De belangrijkste
afwijking is de grote toename van de l[-glycosidische hoek van residu
T4 hetgeen konsequenties heeft voor de base-paring en de stacking-
interacties met respectievelijk de residuen Al3 en G3. Een andere
belangrijke afwijking ten opzichte van de B-DNA structuur is de
buiging van de helix-as van ca. 40o. Voor de herkenning van thymine
dimeren door reparatie enzymen zouden deze verstoringen van de
structuur een belangrijke rol kunnen spelen.
r26


Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies

ARTS repository - University of Groningen

   University of GroningenThymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studiesKemmink, JohanIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1987Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Kemmink, J. (1987). Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 07-06-2022l r- r $l--'l*-lI; ' -  -hl:: -I*ffi,,a . . ,SAMENVATTINGDe erfelijke eigenschappen van levende organismen zijn vastgelegd inDNA rnolekulen in de vorm van een specifieke volgorde van de basenadenine, cytosine, guanine en thymine. Het is essentieel voor deontwikkeiing van levende organismen, dat de DNA rnolekulen zeervaak gedupiiceerd kunnen worden zonder dat de vastgelegde codenoemenswaardig veranderd. Dit vereist een extreem hoge stabiliteitvan het DNA molekuul. In schijnbare tegenspraak hiermee is het feit,dat het DNA wordt blootgesteld aan een groot aantal externefactoren, die de genetische code kunnen verminken. Een van diefactoren is tret ultraviolet licht. De belangrijkste schade veroorzaaktdoor ultraviolet licht is het thymine dimeer, dat op twee manierengevormd kan worden:a. directe absorptie van ultraviolet licht (X x 26A nrn) door eenthymine baseb. absorptie van licht (À - 300 nm) door een ander molekuul (eensensibilisator) waarna de energie wordt overgedragen aan eenthymine base.Er blijken echter een aantal natuurlijke reparatie mechanisrnen tebestaan, die de aangerichte schade kunnen herstellen. Een van dezemechanismen is de fotoreparatie, die wordt gekatalyseerd doorfotoreactiverende enzymen. Deze enzyrnen fi.rngeren in feite alssensibilisator in de splitsingsreactie van het thymine dimeer.In dit proefschrift worden de resultaten gepubliceerd van eenproton NMR onderzoek naar een aantal eigenschappen van thyminedimeren. Aan de orde komen het mechanisme van de splitsing vanthyrnine dimeren, de chemische structuur van thymine dimeren en deveranderingen, die ze teweeg brengen in de conformatie van DNA.In hoofdstuk I wordt het proefschrift ingeleid rnet een kortebeschrijving van:a. de fotochemie van DNA met de nadruk op de thymine dimerenb. de natuurlijke mechanismen, die de fotochemische schade in DNAongedaan kunnen maken3"| : * -tF"*! mIl ,tl123c. de NMR technieken, die toegepast zijn om de verschiilende modelsystemen te onderzoeken.Het mechanisme van de gesensibiliseerde splitsing van thyminedimeren wordt beschreven in hoofdstuk II. Als model systeem is defotoreactie tussen de sensibilisator antrachinon (AQ) en cis-syndimethyithymine dimeer (DMTD) gekozen. Verstoringen van denormale NMR iijnintensiteiten (het foto-CIDNP effect) op deresonantie posities van het monomeer dimethylthymine (DMT) tonenaan, dat de splitsingsreactie verloopt via een ion radikaal paarbestaande uit het kation radikaal DMT]- en het anion radikaal AQ.Uit tijdsafhankelijke foto-CIDNP metingen blijkt, dat de CIDNPeffecten binnen 0.2 ps na initiatie van de fotoreactie ontstaan, hetgeeneen indicatie geeft voor de snelheid van het splitsingsproces. Vrij in deoplossing bewegende kation radikalen DMTt compenseren hetCIDNP effect weer gedeeltelijk door disproportionerings reacties.In hoofdstuk iII komt het belangrijkste model systeem, dat in ditproefschrift wordt beschreven, aan de orde: Een duplex bestaande uitde twee komplementaire DNA strengen d(GCGTTGCG) end(CGCAACGC). Bestraling van dit duplex met ultraviolet licht heeftdimerisatie van ca. 370 van de thymines tot gevolg. Hetzelfde thyminedimeer, dat in DNA in principe in vier isomere vormen voor kankomen, wordt gevormd na bestraling van de enkele strengd(GCGTTGCG) met een opbrengst van ca.207o. Na scheiding van hetgedimeriseerde en niet-gedimeriseerde enkel strengs materiaal wordt dekomplementaire streng d(CGCAACGC) in een i:1 verhouding aan dethymine dimeer streng d(GCGTTGCG) toegevoegd. Om aan te tonen,dat een dergelijk duplex representatief is voor natuurlijk DNA metstralingsschade, wordt het thymine dimeer duplex samengebracht meteen fotoreactiverend enzym verkregen uit de cyanobacterie Anacystis]{idulans en bestraald met zichtbaar licht. Met optische en NMRspectrosopie wordt aangetoond, dat het oorspronkelijke duplex weerteruggevormd wordt.Bestraling van het dinucleotide d(TpT) in aanwezigheid van desensibilisator acetofenon levert twee isomere thymine dimeren op ineen verhouding van 6:l (hoofstuk IV). Na zuivering kunnen beideprodukten met behuip van 2D NMR technieken (2D NOE en COSY)geidentificeerd worden. Het fotoprodukt met de hoogste opbrengstblijkt het cis-syn isomeer te zijn met beide l/-glycosidische bindingen inde ANTI conformatie. Het andere fotoprodukt is het ïrons-syn isomeerrnet de l/-glycosidische binding van het nucleotide aan de 5'kant in de124hISYN conformatie en de N-glycosidische binding aan de 3'kant in deANTI conformatie. Uit een analyse van de "/ koqPelings-konstantenvan de desoxyribose protonen in het cis-syn d(TpT) blijkt, dat devoornaamste conformatie van de desoxyribose behorend bij hetnucleotide aan de 3'kant sterk veranderd is ten opzichte van het niet-gedimeriseerde dinucleotide (l'-exo in plaats van 2'-endo). Deconformaties van de desoxyribose van het 5'nucleotide zijnvergelijkbaar met die in het niet-dimeriseerde dinucleotide. In hettrans-syn isomeer vertonen beide desoxyriboses een afwijkend gedrag:Een voorkeur voor een pure 2'-endo conformatie wordt waargenomen.De hoofdstukken V, VI en VII zijn gewijd aan een nadereanalyse van het dubbel strengs octameer d(GCGTTGCG).d(CGCAACGC). De eerste stap is een zo volledig mogelijke spectraletoekenning van de protonen. In hoofdstuk V wordt de toekenning vande niet-uitwisselbare protonen beschreven. Met behulp van 2Dhomonucleaire Hartmann-Hahn en 2D NOE spectroscopie wordenalle base-protonen en de meeste desoxyribose protonen toegekend. Tervergelijking wordt dit ook met het dubbel strengs octameer zonderthymine dimeer gedaan. Hieruit blijkt dat het bestraalde octameer eencis-syn thymine dimeer bevat van het cyclobutaan type. Eenvergelijking van de 2D NOE spectra en de proton chemical shifts vanbeide dubbel strengs octameren toont aan, dat thymine dimeervorming niet veel invloed heeft op de normale B-DNA structuur:Verstoring van de structuur blijft beperkt tot een gebied van tenhoogste vier base-paren.De dubbele helix structuur van DNA wordt gestabiliseerd oorwaterbruggen tussen de basen adenine en thymine enerzijds encytosine en guanine anderzijds. In hoofdstuk VI wordt de invloed vanthymine dimeer vorming op de stabiliteit van de dubbele helixbesproken. Uitstekende probes hiervoor zlin de uitwisselbare imino-protonen van thymine en guanine, die normaliter betrokken zijn in dewaterstoÍbruggen. Op de imino-protonen van de eindstandige base-paren na kunnen alle imino-protonen in het thymine dimeer duplexworden gedetecteerd en toegekend. Uit een vergelijking met het imino-proton spectrum van het duplex zonder thymine dimeer volgt, dat deGC base-paren volledig intact blijven. De twee AT base-paren wordenechter aanzienlijk verzwakt door thymine dimeer vorming. Het gevolgis een daling in de smelttemperatuur van de dubbele helix van l3o C.In hoofstuk VII worden NMR spectroscopie n theoretische methodengecombineerd om de structuur van het thymine dimeer duplex tei.|: _.-| ! J IE . r -  r i - -* r  - - , , . -tsoF||*- -:] b * : : - -bour]  *  - -t25berekenen. Uit een serie 2D NOE spectra opgenomen metverschillende mengtijden konden met een redelijke nauwkeurigheid(i l0%o) I 13 proton-proton afstanden in het thymine dimeer duplexworden opgemeten. In energie-minimalisatie (EM) en molekulairedynamica (MD) berekeningen werden deze afstanden alsrandvootwaarden meegenomen. Het resultaat van de berekeningen iseen structuur, die gemiddeld genomen van het B-type is. Sommigelocale conformatie parameters vertonen echter behoorlijke afwijkingenten opzichte van hun waarden in normaal B-DNA. De belangrijksteafwijking is de grote toename van de l[-glycosidische hoek van residuT4 hetgeen konsequenties heeft voor de base-paring en de stacking-interacties met respectievelijk de residuen Al3 en G3. Een anderebelangrijke afwijking ten opzichte van de B-DNA structuur is debuiging van de helix-as van ca. 40o. Voor de herkenning van thyminedimeren door reparatie enzymen zouden deze verstoringen van destructuur een belangrijke rol kunnen spelen.r26

Dutch

   University of GroningenThymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studiesKemmink, JohanIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1987Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Kemmink, J. (1987). Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).The publication may also be distributed here under the terms of Article 25fa of the Dutch Copyright Act, indicated by the “Taverne” license.More information can be found on the University of Groningen website: https://www.rug.nl/library/open-access/self-archiving-pure/taverne-amendment.Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 16-07-2023l r- r $l--'l*-lI; ' -  -hl:: -I*ffi,,a . . ,SAMENVATTINGDe erfelijke eigenschappen van levende organismen zijn vastgelegd inDNA rnolekulen in de vorm van een specifieke volgorde van de basenadenine, cytosine, guanine en thymine. Het is essentieel voor deontwikkeiing van levende organismen, dat de DNA rnolekulen zeervaak gedupiiceerd kunnen worden zonder dat de vastgelegde codenoemenswaardig veranderd. Dit vereist een extreem hoge stabiliteitvan het DNA molekuul. In schijnbare tegenspraak hiermee is het feit,dat het DNA wordt blootgesteld aan een groot aantal externefactoren, die de genetische code kunnen verminken. Een van diefactoren is tret ultraviolet licht. De belangrijkste schade veroorzaaktdoor ultraviolet licht is het thymine dimeer, dat op twee manierengevormd kan worden:a. directe absorptie van ultraviolet licht (X x 26A nrn) door eenthymine baseb. absorptie van licht (À - 300 nm) door een ander molekuul (eensensibilisator) waarna de energie wordt overgedragen aan eenthymine base.Er blijken echter een aantal natuurlijke reparatie mechanisrnen tebestaan, die de aangerichte schade kunnen herstellen. Een van dezemechanismen is de fotoreparatie, die wordt gekatalyseerd doorfotoreactiverende enzymen. Deze enzyrnen fi.rngeren in feite alssensibilisator in de splitsingsreactie van het thymine dimeer.In dit proefschrift worden de resultaten gepubliceerd van eenproton NMR onderzoek naar een aantal eigenschappen van thyminedimeren. Aan de orde komen het mechanisme van de splitsing vanthyrnine dimeren, de chemische structuur van thymine dimeren en deveranderingen, die ze teweeg brengen in de conformatie van DNA.In hoofdstuk I wordt het proefschrift ingeleid rnet een kortebeschrijving van:a. de fotochemie van DNA met de nadruk op de thymine dimerenb. de natuurlijke mechanismen, die de fotochemische schade in DNAongedaan kunnen maken3"| : * -tF"*! mIl ,tl123c. de NMR technieken, die toegepast zijn om de verschiilende modelsystemen te onderzoeken.Het mechanisme van de gesensibiliseerde splitsing van thyminedimeren wordt beschreven in hoofdstuk II. Als model systeem is defotoreactie tussen de sensibilisator antrachinon (AQ) en cis-syndimethyithymine dimeer (DMTD) gekozen. Verstoringen van denormale NMR iijnintensiteiten (het foto-CIDNP effect) op deresonantie posities van het monomeer dimethylthymine (DMT) tonenaan, dat de splitsingsreactie verloopt via een ion radikaal paarbestaande uit het kation radikaal DMT]- en het anion radikaal AQ.Uit tijdsafhankelijke foto-CIDNP metingen blijkt, dat de CIDNPeffecten binnen 0.2 ps na initiatie van de fotoreactie ontstaan, hetgeeneen indicatie geeft voor de snelheid van het splitsingsproces. Vrij in deoplossing bewegende kation radikalen DMTt compenseren hetCIDNP effect weer gedeeltelijk door disproportionerings reacties.In hoofdstuk iII komt het belangrijkste model systeem, dat in ditproefschrift wordt beschreven, aan de orde: Een duplex bestaande uitde twee komplementaire DNA strengen d(GCGTTGCG) end(CGCAACGC). Bestraling van dit duplex met ultraviolet licht heeftdimerisatie van ca. 370 van de thymines tot gevolg. Hetzelfde thyminedimeer, dat in DNA in principe in vier isomere vormen voor kankomen, wordt gevormd na bestraling van de enkele strengd(GCGTTGCG) met een opbrengst van ca.207o. Na scheiding van hetgedimeriseerde en niet-gedimeriseerde enkel strengs materiaal wordt dekomplementaire streng d(CGCAACGC) in een i:1 verhouding aan dethymine dimeer streng d(GCGTTGCG) toegevoegd. Om aan te tonen,dat een dergelijk duplex representatief is voor natuurlijk DNA metstralingsschade, wordt het thymine dimeer duplex samengebracht meteen fotoreactiverend enzym verkregen uit de cyanobacterie Anacystis]{idulans en bestraald met zichtbaar licht. Met optische en NMRspectrosopie wordt aangetoond, dat het oorspronkelijke duplex weerteruggevormd wordt.Bestraling van het dinucleotide d(TpT) in aanwezigheid van desensibilisator acetofenon levert twee isomere thymine dimeren op ineen verhouding van 6:l (hoofstuk IV). Na zuivering kunnen beideprodukten met behuip van 2D NMR technieken (2D NOE en COSY)geidentificeerd worden. Het fotoprodukt met de hoogste opbrengstblijkt het cis-syn isomeer te zijn met beide l/-glycosidische bindingen inde ANTI conformatie. Het andere fotoprodukt is het ïrons-syn isomeerrnet de l/-glycosidische binding van het nucleotide aan de 5'kant in de124hISYN conformatie en de N-glycosidische binding aan de 3'kant in deANTI conformatie. Uit een analyse van de "/ koqPelings-konstantenvan de desoxyribose protonen in het cis-syn d(TpT) blijkt, dat devoornaamste conformatie van de desoxyribose behorend bij hetnucleotide aan de 3'kant sterk veranderd is ten opzichte van het niet-gedimeriseerde dinucleotide (l'-exo in plaats van 2'-endo). Deconformaties van de desoxyribose van het 5'nucleotide zijnvergelijkbaar met die in het niet-dimeriseerde dinucleotide. In hettrans-syn isomeer vertonen beide desoxyriboses een afwijkend gedrag:Een voorkeur voor een pure 2'-endo conformatie wordt waargenomen.De hoofdstukken V, VI en VII zijn gewijd aan een nadereanalyse van het dubbel strengs octameer d(GCGTTGCG).d(CGCAACGC). De eerste stap is een zo volledig mogelijke spectraletoekenning van de protonen. In hoofdstuk V wordt de toekenning vande niet-uitwisselbare protonen beschreven. Met behulp van 2Dhomonucleaire Hartmann-Hahn en 2D NOE spectroscopie wordenalle base-protonen en de meeste desoxyribose protonen toegekend. Tervergelijking wordt dit ook met het dubbel strengs octameer zonderthymine dimeer gedaan. Hieruit blijkt dat het bestraalde octameer eencis-syn thymine dimeer bevat van het cyclobutaan type. Eenvergelijking van de 2D NOE spectra en de proton chemical shifts vanbeide dubbel strengs octameren toont aan, dat thymine dimeervorming niet veel invloed heeft op de normale B-DNA structuur:Verstoring van de structuur blijft beperkt tot een gebied van tenhoogste vier base-paren.De dubbele helix structuur van DNA wordt gestabiliseerd oorwaterbruggen tussen de basen adenine en thymine enerzijds encytosine en guanine anderzijds. In hoofdstuk VI wordt de invloed vanthymine dimeer vorming op de stabiliteit van de dubbele helixbesproken. Uitstekende probes hiervoor zlin de uitwisselbare imino-protonen van thymine en guanine, die normaliter betrokken zijn in dewaterstoÍbruggen. Op de imino-protonen van de eindstandige base-paren na kunnen alle imino-protonen in het thymine dimeer duplexworden gedetecteerd en toegekend. Uit een vergelijking met het imino-proton spectrum van het duplex zonder thymine dimeer volgt, dat deGC base-paren volledig intact blijven. De twee AT base-paren wordenechter aanzienlijk verzwakt door thymine dimeer vorming. Het gevolgis een daling in de smelttemperatuur van de dubbele helix van l3o C.In hoofstuk VII worden NMR spectroscopie n theoretische methodengecombineerd om de structuur van het thymine dimeer duplex tei.|: _.-| ! J IE . r -  r i - -* r  - - , , . -tsoF||*- -:] b * : : - -bour]  *  - -t25berekenen. Uit een serie 2D NOE spectra opgenomen metverschillende mengtijden konden met een redelijke nauwkeurigheid(i l0%o) I 13 proton-proton afstanden in het thymine dimeer duplexworden opgemeten. In energie-minimalisatie (EM) en molekulairedynamica (MD) berekeningen werden deze afstanden alsrandvootwaarden meegenomen. Het resultaat van de berekeningen iseen structuur, die gemiddeld genomen van het B-type is. Sommigelocale conformatie parameters vertonen echter behoorlijke afwijkingenten opzichte van hun waarden in normaal B-DNA. De belangrijksteafwijking is de grote toename van de l[-glycosidische hoek van residuT4 hetgeen konsequenties heeft voor de base-paring en de stacking-interacties met respectievelijk de residuen Al3 en G3. Een anderebelangrijke afwijking ten opzichte van de B-DNA structuur is debuiging van de helix-as van ca. 40o. Voor de herkenning van thyminedimeren door reparatie enzymen zouden deze verstoringen van destructuur een belangrijke rol kunnen spelen.r26

University of Groningen

   University of GroningenThymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studiesKemmink, JohanIMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite fromit. Please check the document version below.Document VersionPublisher's PDF, also known as Version of recordPublication date:1987Link to publication in University of Groningen/UMCG research databaseCitation for published version (APA):Kemmink, J. (1987). Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies. s.n.CopyrightOther than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of theauthor(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).Take-down policyIf you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediatelyand investigate your claim.Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons thenumber of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.Download date: 12-11-2019l r- r $l--'l*-lI; ' -  -hl:: -I*ffi,,a . . ,SAMENVATTINGDe erfelijke eigenschappen van levende organismen zijn vastgelegd inDNA rnolekulen in de vorm van een specifieke volgorde van de basenadenine, cytosine, guanine en thymine. Het is essentieel voor deontwikkeiing van levende organismen, dat de DNA rnolekulen zeervaak gedupiiceerd kunnen worden zonder dat de vastgelegde codenoemenswaardig veranderd. Dit vereist een extreem hoge stabiliteitvan het DNA molekuul. In schijnbare tegenspraak hiermee is het feit,dat het DNA wordt blootgesteld aan een groot aantal externefactoren, die de genetische code kunnen verminken. Een van diefactoren is tret ultraviolet licht. De belangrijkste schade veroorzaaktdoor ultraviolet licht is het thymine dimeer, dat op twee manierengevormd kan worden:a. directe absorptie van ultraviolet licht (X x 26A nrn) door eenthymine baseb. absorptie van licht (À - 300 nm) door een ander molekuul (eensensibilisator) waarna de energie wordt overgedragen aan eenthymine base.Er blijken echter een aantal natuurlijke reparatie mechanisrnen tebestaan, die de aangerichte schade kunnen herstellen. Een van dezemechanismen is de fotoreparatie, die wordt gekatalyseerd doorfotoreactiverende enzymen. Deze enzyrnen fi.rngeren in feite alssensibilisator in de splitsingsreactie van het thymine dimeer.In dit proefschrift worden de resultaten gepubliceerd van eenproton NMR onderzoek naar een aantal eigenschappen van thyminedimeren. Aan de orde komen het mechanisme van de splitsing vanthyrnine dimeren, de chemische structuur van thymine dimeren en deveranderingen, die ze teweeg brengen in de conformatie van DNA.In hoofdstuk I wordt het proefschrift ingeleid rnet een kortebeschrijving van:a. de fotochemie van DNA met de nadruk op de thymine dimerenb. de natuurlijke mechanismen, die de fotochemische schade in DNAongedaan kunnen maken3"| : * -tF"*! mIl ,tl123c. de NMR technieken, die toegepast zijn om de verschiilende modelsystemen te onderzoeken.Het mechanisme van de gesensibiliseerde splitsing van thyminedimeren wordt beschreven in hoofdstuk II. Als model systeem is defotoreactie tussen de sensibilisator antrachinon (AQ) en cis-syndimethyithymine dimeer (DMTD) gekozen. Verstoringen van denormale NMR iijnintensiteiten (het foto-CIDNP effect) op deresonantie posities van het monomeer dimethylthymine (DMT) tonenaan, dat de splitsingsreactie verloopt via een ion radikaal paarbestaande uit het kation radikaal DMT]- en het anion radikaal AQ.Uit tijdsafhankelijke foto-CIDNP metingen blijkt, dat de CIDNPeffecten binnen 0.2 ps na initiatie van de fotoreactie ontstaan, hetgeeneen indicatie geeft voor de snelheid van het splitsingsproces. Vrij in deoplossing bewegende kation radikalen DMTt compenseren hetCIDNP effect weer gedeeltelijk door disproportionerings reacties.In hoofdstuk iII komt het belangrijkste model systeem, dat in ditproefschrift wordt beschreven, aan de orde: Een duplex bestaande uitde twee komplementaire DNA strengen d(GCGTTGCG) end(CGCAACGC). Bestraling van dit duplex met ultraviolet licht heeftdimerisatie van ca. 370 van de thymines tot gevolg. Hetzelfde thyminedimeer, dat in DNA in principe in vier isomere vormen voor kankomen, wordt gevormd na bestraling van de enkele strengd(GCGTTGCG) met een opbrengst van ca.207o. Na scheiding van hetgedimeriseerde en niet-gedimeriseerde enkel strengs materiaal wordt dekomplementaire streng d(CGCAACGC) in een i:1 verhouding aan dethymine dimeer streng d(GCGTTGCG) toegevoegd. Om aan te tonen,dat een dergelijk duplex representatief is voor natuurlijk DNA metstralingsschade, wordt het thymine dimeer duplex samengebracht meteen fotoreactiverend enzym verkregen uit de cyanobacterie Anacystis]{idulans en bestraald met zichtbaar licht. Met optische en NMRspectrosopie wordt aangetoond, dat het oorspronkelijke duplex weerteruggevormd wordt.Bestraling van het dinucleotide d(TpT) in aanwezigheid van desensibilisator acetofenon levert twee isomere thymine dimeren op ineen verhouding van 6:l (hoofstuk IV). Na zuivering kunnen beideprodukten met behuip van 2D NMR technieken (2D NOE en COSY)geidentificeerd worden. Het fotoprodukt met de hoogste opbrengstblijkt het cis-syn isomeer te zijn met beide l/-glycosidische bindingen inde ANTI conformatie. Het andere fotoprodukt is het ïrons-syn isomeerrnet de l/-glycosidische binding van het nucleotide aan de 5'kant in de124hISYN conformatie en de N-glycosidische binding aan de 3'kant in deANTI conformatie. Uit een analyse van de "/ koqPelings-konstantenvan de desoxyribose protonen in het cis-syn d(TpT) blijkt, dat devoornaamste conformatie van de desoxyribose behorend bij hetnucleotide aan de 3'kant sterk veranderd is ten opzichte van het niet-gedimeriseerde dinucleotide (l'-exo in plaats van 2'-endo). Deconformaties van de desoxyribose van het 5'nucleotide zijnvergelijkbaar met die in het niet-dimeriseerde dinucleotide. In hettrans-syn isomeer vertonen beide desoxyriboses een afwijkend gedrag:Een voorkeur voor een pure 2'-endo conformatie wordt waargenomen.De hoofdstukken V, VI en VII zijn gewijd aan een nadereanalyse van het dubbel strengs octameer d(GCGTTGCG).d(CGCAACGC). De eerste stap is een zo volledig mogelijke spectraletoekenning van de protonen. In hoofdstuk V wordt de toekenning vande niet-uitwisselbare protonen beschreven. Met behulp van 2Dhomonucleaire Hartmann-Hahn en 2D NOE spectroscopie wordenalle base-protonen en de meeste desoxyribose protonen toegekend. Tervergelijking wordt dit ook met het dubbel strengs octameer zonderthymine dimeer gedaan. Hieruit blijkt dat het bestraalde octameer eencis-syn thymine dimeer bevat van het cyclobutaan type. Eenvergelijking van de 2D NOE spectra en de proton chemical shifts vanbeide dubbel strengs octameren toont aan, dat thymine dimeervorming niet veel invloed heeft op de normale B-DNA structuur:Verstoring van de structuur blijft beperkt tot een gebied van tenhoogste vier base-paren.De dubbele helix structuur van DNA wordt gestabiliseerd oorwaterbruggen tussen de basen adenine en thymine enerzijds encytosine en guanine anderzijds. In hoofdstuk VI wordt de invloed vanthymine dimeer vorming op de stabiliteit van de dubbele helixbesproken. Uitstekende probes hiervoor zlin de uitwisselbare imino-protonen van thymine en guanine, die normaliter betrokken zijn in dewaterstoÍbruggen. Op de imino-protonen van de eindstandige base-paren na kunnen alle imino-protonen in het thymine dimeer duplexworden gedetecteerd en toegekend. Uit een vergelijking met het imino-proton spectrum van het duplex zonder thymine dimeer volgt, dat deGC base-paren volledig intact blijven. De twee AT base-paren wordenechter aanzienlijk verzwakt door thymine dimeer vorming. Het gevolgis een daling in de smelttemperatuur van de dubbele helix van l3o C.In hoofstuk VII worden NMR spectroscopie n theoretische methodengecombineerd om de structuur van het thymine dimeer duplex tei.|: _.-| ! J IE . r -  r i - -* r  - - , , . -tsoF||*- -:] b * : : - -bour]  *  - -t25berekenen. Uit een serie 2D NOE spectra opgenomen metverschillende mengtijden konden met een redelijke nauwkeurigheid(i l0%o) I 13 proton-proton afstanden in het thymine dimeer duplexworden opgemeten. In energie-minimalisatie (EM) en molekulairedynamica (MD) berekeningen werden deze afstanden alsrandvootwaarden meegenomen. Het resultaat van de berekeningen iseen structuur, die gemiddeld genomen van het B-type is. Sommigelocale conformatie parameters vertonen echter behoorlijke afwijkingenten opzichte van hun waarden in normaal B-DNA. De belangrijksteafwijking is de grote toename van de l[-glycosidische hoek van residuT4 hetgeen konsequenties heeft voor de base-paring en de stacking-interacties met respectievelijk de residuen Al3 en G3. Een anderebelangrijke afwijking ten opzichte van de B-DNA structuur is debuiging van de helix-as van ca. 40o. Voor de herkenning van thyminedimeren door reparatie enzymen zouden deze verstoringen van destructuur een belangrijke rol kunnen spelen.r26

https://pure.rug.nl/ws/files/3384311/kemmink.PDF

Thymine Photodimers. Two-dimensional NMR and photo-CIDNP studies

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

University of Groningen Research Database

ARTS repository - University of Groningen

ARTS repository - University of Groningen

University of Groningen