MicroRNAs (miRNAs) are short non-coding RNAs that post-transcriptionally regulate the expression of different target genes and, thus, potentially offer the opportunity to engineer networks of genes in order to achieve complex phenotypic changes in mammalian cells. The goal of this thesis was to explore whether this feature of miRNAs could be exploited as a strategy to improve therapeutic protein production processes by increasing the viable cell densities and/or productivity of mammalian producer cells. To identify miRNAs that increase the productivity of producer cells, a genome-wide functional miRNA screen was established and performed in Chinese hamster ovary (CHO) cells stably expressing an IgG1 that were grown in suspension in chemically defined medium. Using this approach nineteen human miRNAs were identified that significantly improved IgG titers in the primary screen. Almost half of these miRNAs could be validated to significantly increase the IgG concentrations and/or specific productivity when transiently introduced into CHO producer cells in a secondary screen. The increased titers of recombinant human serum albumin analyzed as a second secreted model protein pointed to product independent effects of most of the validated miRNAs. In addition, two of the validated miRNAs, hsa-miR-557 and hsa-miR-1978, also increased the secretion of an endogenously as well as a transiently expressed model protein in human cells, indicating that these miRNAs manipulate the cellular machinery by a universal mechanism. The strongest impact on the specific productivity of CHO cells was observed by a dead entry and thus artificial miRNA (hsa-miR-1978), which may represent a promising molecular tool for future synthetic biology approaches aimed at optimizing producer cells.
For further studies, the two miRNAs hsa-miR-557 and hsa-miR-1287, positively impacting the viable cell density and specific productivity, respectively, were selected. Transient experiments supported the idea of combining these two miRNAs to further boost cellular productivity. Using a vector-based expression system, CHO pools stably overexpressing these human miRNAs were successfully generated allowing the study of miRNA-engineered producer cells under industrially relevant culture conditions such as fed-batch cultivation. Importantly, three independent cell pools stably coexpressing miR-557 and miR-1287 gave rise to significantly increased IgG titers by 30% in fed-batch cultures whilst product quality was conserved, proving the transferability of the transient results to a stable setting. Taken together, these results demonstrate that miRNA-based cell line engineering is an attractive approach toward the genetic optimization of CHO host cells for industrial applications.MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nichtcodierende RNAs, die die Expression verschiedener Zielgene posttranskriptional regulieren und somit potentiell die Möglichkeit bieten, Netzwerke von Genen zu beeinflussen, um komplexe phänotypische Veränderungen in Säugerzellen zu erreichen. Das Ziel dieser Doktorarbeit war zu untersuchen, ob diese Eigenschaft von miRNAs als Strategie genutzt werden kann, um Prozesse zur Produktion von therapeutischen Proteinen durch Erhöhung der vitalen Zelldichten und/oder der Produktivität von Säugerzellen zu verbessern. Um miRNAs zu identifizieren, die in der Lage sind, die Produktivität von Produktionszellen zu steigern, wurde ein genomweiter funktionaler miRNA Screen etabliert und in Chinesischen Hamster Ovarien (CHO) Zellen, die stabil einen IgG Antikörper sezernieren und in Suspension in chemisch definiertem Medium wachsen, durchgeführt. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnten neunzehn humane miRNAs in einem primären Screen identifiziert werden, die signifikant die IgG Konzentrationen steigerten. Nahezu die Hälfte dieser miRNAs konnte in einem sekundären Screen bestätigt werden, indem signifikant erhöhte IgG Konzentrationen beziehungsweise spezifische Produktivität nach transienter Transfektion der Produktionszellen nachgewiesen wurden. Die erhöhten Titer des rekombinanten humanen Serumalbumins, welches als zweites sezerniertes Modellprodukt analysiert wurde, wiesen auf produktunabhängige Effekte der meisten validierten miRNAs hin. Darüber hinaus steigerten zwei der validierten miRNAs, nämlich hsa-miR-557 und hsa-miR-1978, sowohl die Sekretion eines endogenen als auch eines transient exprimierten Modellproduktes in humanen Zellen, was auf die Manipulation eines universellen Mechanismus hindeutet. Der stärkste Einfluss auf die spezifische Produktivität von CHO Zellen wurde durch eine miRNA hervorgerufen, die als nicht mehr gültiger Datenbankeintrag aufgeführt ist und somit eine artifizielle RNA darstellt. Diese „miRNA“ könnte damit in zukünftigen synthetischen Biologie-Ansätzen als ein molekulares Werkzeug zur Optimierung von Produktionszellen dienen.
Für weiterführende Studien wurden zwei miRNAs, die einen positiven Einfluss auf die vitale Zelldichte (hsa-miR-557) bzw. die spezifische Produktivität (hsa-miR-1287) hatten, ausgewählt. Die Ergebnisse transienter Studien unterstützten die Idee, eine Kombination dieser zwei miRNAs zu verwenden, um die zelluläre Produktivität weiter zu steigern. Unter Verwendung eines Vektor-basierten Expressionssystems wurden erfolgreich CHO Pools generiert, die diese miRNAs stabil überexprimierten. Dies erlaubte die Untersuchung von miRNA-manipulierten Produktionszellen unter industriell relevanten Kulturbedingungen wie es die Fed-Batch Kultivierung darstellt. Von besonderer Bedeutung ist, dass für drei unabhängige Zellpools, die stabil miR-557 und miR-1287 koexprimierten, in Fed-Batch Kultivierungen eine signifikante Steigerung der IgG-Titer um 30% gemessen wurde, während die Produktqualität erhalten blieb. Dies beweist die Übertragbarkeit der transienten Ergebnisse auf einen stabilen Ansatz. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit auf, dass die miRNA-basierte Zelllinienentwicklung ein attraktiver Ansatz zur genetischen Optimierung von CHO Wirtszellen für die industrielle Anwendung ist