Orientador :  Prof. Paulo Henrique da SilvaMonografia (especialização) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências, Curso de Especialização em Análise ClínicasInclui referênciasResumo: - O objetivo do trabalho foi estabelecer média, desvio padrão e intervalo de referência da atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6-PD) em crianças saudáveis atendidas no Laboratório Escola da Universidade Federal do Paraná. Foram analisadas amostras de 100 crianças (9 a 11 anos) consideradas normais após análise do hemograma e eletroforese de hemoglobinas. A atividade enzimática foi determinada quantitativamente nas hemácias utilizando-se os reagentes do kit G6-PD da Randox, em analisador automático Cobas Mira (Roche). A média da atividade da G6-PD em crianças foi de 6,16 ± 1,14 U/g Hb, e o valor de referência estabelecido foi de 3,84 a 8,51 U/g Hb. O intervalo de referência encontrado foi menor do que os valores estabelecidos na bula do kit

Furman, Aline Emmer Ferreira

Portuguese

Repositório Digital Institucional da UFPR

Níveis de atividade enzimática da glicose 6-fosfato desidrogenase em crianças, no Laboratório Escola da Universidade Federal do Paraná

Acervo Digital da UFPR (Univ. Federal do Paraná)

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ  ALINE EMMER FERREIRA FURMAN            NÍVEIS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA GLICOSE 6-FOSFATO DESIDROGENASE EM CRIANÇAS, NO LABORATÓRIO ESCOLA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ                        CURITIBA 2013ALINE EMMER FERREIRA FURMAN              NÍVEIS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA GLICOSE 6-FOSFATO DESIDROGENASE EM CRIANÇAS, NO LABORATÓRIO ESCOLA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ   Artigo apresentado como requisito parcial à obtenção do título de Especialista em Análises Clínicas, pela Universidade Federal do Paraná.  Orientador: Prof. Paulo Henrique da Silva           CURITIBA 2013 Níveis de atividade enzimática da glicose 6-fosfato desidrogenase em crianças, no Laboratório Escola da Universidade Federal do Paraná   FURMAN*, A.E.F ¹; HENNEBERG, R.¹; NASCIMENTO, A.J²; SILVA, P.H.³  1 Laboratório-Escola de Análises Clínicas, UFPR  2 Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFPR  3 Laboratório de Citologia e Hematologia, UFPR       RESUMO - O objetivo do trabalho foi estabelecer média, desvio padrão e intervalo de referência da atividade da enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6-PD) em crianças saudáveis atendidas no Laboratório Escola da Universidade Federal do Paraná. Foram analisadas amostras de 100 crianças (9 a 11 anos) consideradas normais após análise do hemograma e eletroforese de hemoglobinas. A atividade enzimática foi determinada quantitativamente nas hemácias utilizando-se os reagentes do kit G6-PD da Randox, em analisador automático Cobas Mira (Roche). A média da atividade da G6-PD em crianças foi de 6,16 ± 1,14 U/g Hb, e o valor de referência estabelecido foi de 3,84 a 8,51 U/g Hb. O intervalo de referência encontrado foi menor do que os valores estabelecidos na bula do kit.  Palavras-chaves: Glucosefosfato Desidrogenase. Valores de Referência. Criança.               *Laboratório-Escola de Análises Clínicas - Universidade Federal do Paraná – Curitiba – PR. Av. Lothário Meissner, 632 - Jardim Botânico 80210-170 – Curitiba - PR, Brasil Email: alinemmer@hotmail.com INTRODUÇÃO    A enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (G6-PD) fornece aos eritrócitos proteção crucial contra o dano oxidativo. A enzima converte glicose 6-fosfato em 6-fosfogluconato, com conversão acoplada de NAD a NADPH. Essa reação é a única fonte de NADPH no eritrócito, que é necessário para um grande número de reações metabólicas redutoras, incluindo a regeneração da hemoglobina oxidada, através da enzima metahemoglobina redutase, a redução da glutationa oxidada, através da enzima glutationa redutase e finalmente, a conversão do H2O2 a H2O através da enzima glutationa peroxidase (1). A descrição da deficiência da G6-PD deu-se a partir das investigações dos efeitos hemolíticos da droga primaquina, utilizada em pacientes com malária. Esses estudos foram realizados na década de 50 (2,3) e definiu a deficiência de G6-PD como sendo uma deficiência enzimática e hereditária que afeta os eritrócitos. Mostrou-se, também, que a doença é mais prevalente em indivíduos da África, Mediterrâneo e de origem asiática, mas pode ser encontrada em qualquer população. A forma mais comum da doença está associada com anemia hemolítica em determinadas condições de estresse, tais como a administração de drogas oxidantes, processos infecciosos e período neonatal. É a doença enzimática eritrocitária mais comum: a prevalência global é estimada em 4.9%, o que significa cerca de 330 milhões de pessoas afetadas (4).  A enzima normal ou o tipo selvagem é designado pela sigla G6-PD B. A Organização Mundial de Saúde classifica a deficiência da G6-PD em 5 classes variantes, baseadas na atividade enzimática e nas manifestações clínicas (5). A classe I inclui os pacientes que apresentam deficiência enzimática severa e anemia hemolítica crônica. Os pacientes com deficiência enzimática severa - mas com hemólise intermitente - pertencem à classe II. Os da classe III possuem deficiência enzimática moderada, com hemólise intermitente associada a medicamentos e drogas. Os pacientes da classe IV são mutantes para G6-PD, mas não tem deficiência enzimática e nem hemólise. Os da classe V apresentam uma concentração aumentada da enzima. Tanto os pacientes da classe IV como a V são assintomáticos.  A fisiopatologia da deficiência de G6-PD está correlacionada com o tempo de meia-vida da enzima, que em situações fisiológicas é de 62 dias (6) e garante a produção de NADPH para o tempo de meia-vida do eritrócito. O tempo de meia-vida da enzima, quando deficiente, é de apenas 13 dias (6), o que não garante o suprimento de NADPH necessário para a meia-vida eritrocitária. Na medida em que a concentração de NADPH diminui, caem também os níveis de GSH e estabelece-se um quadro de estresse oxidativo, com degradação da hemoglobina em hemicromos ou subprodutos do grupo heme, e a precipitação da globina oxidada sob a forma de corpos de Heinz na membrana, tornando o eritrócito rígido e sem maleabilidade (7). A consequência desta alteração é a fagocitose pelo sistema mononuclear fagocitário, caracterizando o quadro de hemólise. Os corpos de Heinz formam-se durante os episódios de hemólise e não são revelados pelos corantes hematológicos, podendo ser pesquisados por coloração supravital com metilvioleta (8). Os pacientes são sintomáticos somente nos episódios de crise de hemólise e durante estas crises a hemoglobina pode cair entre 3 e 4 g/dl (7). A anemia que se instala é normocítica e normocrômica, com policromatofilia, esferócitos e corpos de Heinz. Pode ocorrer hemólise intravascular com presença de hemoglobinúria e hemosiderinúria (7). O quadro de hemólise inicia entre 2 a 4 dias após a ingestão ou presença do agente oxidante, e a reticulocitose está presente após o quinto dia de exposição, atingindo seu pico máximo entre o sétimo e o décimo dia (6). O diagnóstico laboratorial definitivo é a dosagem da enzima G6-PD, já que a presença de corpos de Heinz não é exclusiva desta deficiência. Na associação da deficiência de G6-PD com hemoglobinopatias, a indução de uma crise hemolítica gera um quadro desastroso, uma vez que esses pacientes já apresentam uma predisposição ao estresse oxidativo.  Portanto, principalmente nesses pacientes, o diagnóstico da deficiência enzimática é de grande importância para o clínico. O diagnóstico da deficiência enzimática é realizado através da determinação quantitativa da atividade da enzima G6-PD. Para isso, o laboratório necessita adotar um intervalo de referência adequado a sua população. A bula do kit utilizado não especifica a idade, sexo, nem localização geográfica da população utilizada para definir seu intervalo de referência. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi estabelecer os valores de referência para a população atendida pelo Laboratório Escola de Análises Clínicas da Universidade Federal do Paraná.       MÉTODO    Foram coletadas amostras de sangue de 60 crianças saudáveis com idade variando entre 9 e 11 anos,  de vários grupos étnicos, no período de tempo compreendido entre outubro e dezembro de 2011. As amostras foram coletadas em anticoagulante EDTA K3. Foram realizados hemograma (T-890, Coulter, EUA) e eletroforese alcalina de hemoglobina. Como critérios de inclusão, foram definidos hemograma e eletroforese de hemoglobina normal.  Para a dosagem da atividade enzimática foi utilizado o teste quantitativo para determinação de G6-PD da Randox (Randox Laboratories, Crumlin, UK) em analisador automático Cobas Mira (Roche Diagnostics, Suiça). O método baseia-se na redução do NADP+ pela enzima G6-PD presente nos eritrócitos. O NADPH formado gera fluorescência sob luz ultravioleta a 340 nm diretamente proporcional à atividade enzimática. A atividade encontrada pelo analisador foi dividida pela concentração de hemoglobina da amostra (g/l), resultando em U/g Hb. Foram utilizados controles normais e deficientes, fornecidos pela Randox.  O projeto foi registrado na Pró-reitoria de Extensão e Cultura (PROEC) da Universidade Federal do Paraná sob o número 472/08 e a amostra foi coletada após assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido pelos participantes do projeto ou por seus responsáveis.  O cálculo da média, desvio padrão, percentis acumulados e o teste de normalidade foram realizados no programa Prism 5 (GraphPad, Inc). A significância estatística foi estabelecida para p<0,05.    RESULTADOS    O valor médio encontrado para a atividade da G6-PD em crianças foi 6,16 ± 1,14 U/g Hb. O intervalo de referência estabelecido foi de 3,84 a 8,51 U/g Hb, para percentis acumulados de 2,5 a 97,5%. O teste de normalidade “D'Agostino & Pearson omnibus” para a amostra estudada mostrou distribuição gaussiana (p=0,4704) (Tab 1).  Número de valores 100 Mínimo 3,81 Percentil 25% 5,33 Mediana 6,15 Percentil 75% 6,77 Máximo 8,62 Percentil 2.5% 3,84 Percentil 97.5% 8,51 Média 6,16 Desvio Padrão 1,14 Desvio Padrão da Média 0,114 Valor mínimo 95% CI da média 5,93 Valor máximo 95% CI da média 6,38 D'Agostino & Pearson omnibus - teste de normalidade  K2 1,51 Valor de P  0,4704 Passa no teste de normalidade (alpha=0.05)? Sim  Tabela 1. Tabulação dos resultados obtidos pelo programa GraphPad Prism.   DISCUSSÃO    A dosagem quantitativa da atividade da G6-PD realiza o diagnóstico definitivo da deficiência enzimática, sendo, portanto, um exame laboratorial muito importante no esclarecimento de anemias hemolíticas agudas, icterícia neonatal ou anemias hemolíticas não esferocíticas crônicas. A metodologia utilizada, após padronização, mostrou-se simples e reprodutível. Porém, os valores de referência encontrados na literatura são muito divergentes. Segundo o International Committee for Standardization in Haematology (9), o valor de referência da atividade da enzima em adultos é de 8,83 ± 1,59 U/g Hb. Greer et al. (10) relatam valores até três vezes maiores como sendo normais. Aliado a isso, a atividade da enzima varia conforme a idade. Os recém-natos têm valores cerca de 150% maiores do que em adultos (11).  A fabricante do kit recomenda que cada laboratório estabeleça os seus próprios valores de referência em relação à idade, sexo, regime alimentar e localização geográfica da população atendida. Outros autores fazem a mesma recomendação (8). Essa informação é realmente muito relevante, já que utilizando o intervalo de referência do fabricante (12), muitos de nossos pacientes seriam enquadrados como deficientes. Os valores de atividade da G6-PD em crianças encontrados nesse trabalho são bem semelhantes aos encontrados por Muller (13), que avaliou a atividade da enzima em 201 crianças de duas creches da cidade de São Paulo.  O quadro 1 mostra alguns valores de referência para a atividade da G6-PD encontrados na literatura:   Valor de referência Idade 8.83 ± 1.59 U/g Hb(9) Adultos 24.8 ± 9.8 (N=10) U/g Hb(10) Adultos 45.2 ± 8.7 (N=10) U/g Hb(10) Recém nato 66.8 ± 34.8 (N=11) U/g Hb(10) Prematuro 6.97 a 20.5 U/g Hb(12) Não se refere à idade 4.49 ± 1.38 (N=201) U/g Hb(13) 18 meses a 13 anos 12.1 ± 2.09 U/g Hb(14) Não se refere à idade Quadro 1. Alguns valores de referência para a G6-PD encontrados na literatura.        CONCLUSÃO    A média de atividade da enzima G6-PD nas crianças analisadas foi de 6,16 U/g Hb, com um desvio padrão de 1,14. O valor de corte em crianças foi de 3,84 U/g Hb. Valores abaixo deste podem ser considerados deficientes para a população estudada. Devido à grande discrepância entre os intervalos de referência encontrados na literatura, sugere-se que cada laboratório estabeleça o valor de corte para a população atendida.  Glucose 6-phosphate dehydrogenase activity levels in children, in School Laboratory of Universidade Federal do Paraná   FURMAN*, A.E.F ¹; HENNEBERG, R.¹; NASCIMENTO, A.J²; SILVA, P.H.³  1 Laboratório-Escola de Análises Clínicas, UFPR  2 Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, UFPR  3 Laboratório de Citologia e Hematologia, UFPR     ABSTRACT: In order to establish mean, standard error and threshold inferior values for glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6-PD) in healthy children in School Laboratory of Universidade Federal do Paraná, blood sample was analyzed from 100 children aging from 9 to 11 years old, considered normal based on hemogram and hemoglobin electrophoresis. The method for G6-PD measurement was the quantitative G6-PD Randox kit, in Cobas Mira analyser.  Mean activivity of G6-PD in children was 6.16 ± 1.14 U/g Hb, and reference values was 3.84 a 8.51 U/g Hb. In conclusion, the reference range was found to be lower than the values established in the kit label.  Keywords: Glucosephosphate Dehydrogenase. Reference values. Child. REFERÊNCIAS   1. Bridges KR, Pearson HA. Anemias and other red cell disorders. New York: Mac Graw Hill, 2008.   2. Beutler E. G6PD deficiency. Blood. 1994; 84:3613.  3. Beutler E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: A historical perspective. Blood. 2008; 111:16.  4. Nkhoma ET, Poole C, Vannappagari V. The global prevalence of glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: A systematic review and meta-analysis. Blood Cell Mol Dis. 2009; 42:267.  5. WHO Working Group. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Bull World Health Organ. 1989; 67:601.  6. Greer JP, Foerster J, Lukens JN. Wintrobe’s Clinical Hematology. 11th ed. Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins; 2004. 2800p.  7. Stiene-Martin EA, Lotspeich-Steininger CA, Koepke JA. Clinical Hematology principles, procedures, correlations. 2nd ed. New York: Lippincott, 1998. 848p.  8. Lewis SM, Bain BJ, Bates I. Hematologia Prática de Dacie e Lewis. 9ª ed. Porto Alegre: Artmed, 2006. 571p.  9. International Committee for Standardization in Haematology. Recommended methods for red-cell enzyme analysis. British Journal of Haematology, 1977; 35:331.  10. Greer JP, Foerster J, Rodgers GM, Paraskevas F, Glader B, Arber DA, Means RT. Wintrobe’s Clinical Hematology. 12th ed. Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins; 2009. 3232p.  11. Oski FA. Red cell metabolism in the newborn infant: V. Glycolytic intermediates and glycolytic enzymes. Pediatrics. 1969; 44:84-91.  12. Glicose 6-fosfato desidrogenase. Gisele Pedrosa Barros. São Paulo: Randox Brasil, 2010. Bula de kit.    13. Muller R. Use of a simplified spectrophotometric method for quantitative determination of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in normal children from two day-care centers of the city of São Paulo. Einstein, 2003; 1:89-94.  14. Oliveira RAG, Neto AP. Anemias e Leucemias: conceitos básicos e diagnóstico por técnicas laboratoriais. São Paulo: Roca; 2004. 436p.   

https://acervodigital.ufpr.br/xmlui/bitstream/handle/1884/50967/R%20-%20E%20-%20ALINE%20EMMER%20FERREIRA%20FURMAN.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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